Preserving the blood-brain barrier: a way of preventing breast cancer brain metastases

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silvestre, Rafaela Flauzino
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/54597
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.
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spelling Preserving the blood-brain barrier: a way of preventing breast cancer brain metastasesBlood-brain barrierBreast cancer brain metastasesMinocycline hydrochlorideTransferrin receptorLiposomesTeses de mestrado -2021Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.O cancro da mama (CM) é o tipo de cancro mais diagnosticado em mulheres, com mais de 2 milhões de novos casos em 2020, das quais 685000 representam óbitos. A grande maioria das mortes estão associados à doença metastática, quando células do tumor primário ganham capacidade de espalhar e crescer em órgãos distantes. O CM pode ser dividido em vários subtipos, sendo o triplo-negativo o mais agressivo e mais rápido a desenvolver metástases, nomeadamente no encéfalo. Infelizmente, uma vez estabelecidas as metástases encefálicas, as opções de tratamento são bastante limitadas, levando a um prognóstico assolador com apenas 20% de taxa de sobrevivência ao fim de 1 ano. Durante a cascata metastática, as células do CM (CCM) ganham capacidades invasivas e migratórias, invadindo o tecido adjacente e deixando o tumor primário. Uma vez em circulação, encontram a barreira hematoencefálica (BHE), uma barreira altamente especializada, caracterizada pela expressão de complexos intercelulares elaborados que limitam o transporte da maioria dos compostos para o encéfalo. Por esta razão, uma vez estabelecidas as metástases encefálicas, as opções terapêuticas tornam-se muito reduzidas. Apesar de ser uma barreira bastante impermeável, as CCM circulantes são capazes de aderir às células endoteliais damicrovasculatura encefálica (CEME), comprometer as junções intercelulares e a integridade da BHE e levar à abertura de buracos na mesma. Aliado a este processo, podem estar envolvidos outros fatores, como por exemplo a metaloproteinase-9 (MMP-9). Esta está associada à remodelação da matriz extracelular e, por consequência, pode facilitar a transmigração das células tumorais e a posterior instalação no sistema nervoso central. Num estudo prévio, o nosso grupo examinou uma biblioteca de moléculas quanto à sua capacidade de modular as propriedades da BHE e prevenir o seu rompimento induzido por CCM triplo-negativo. Em particular, o cloridrato de minociclina (MH), um antibiótico usado na prática clínica há mais de 30 anos e que mais recentemente tem sido estudado pelo seu efeito neuroprotetor, foi identificado como o melhor candidato para prosseguir os estudos.De modo a minimizar possíveis efeitos colaterais de uso prolongado de um antibiótico e garantir uma entrega específica à BHE, um sistema de veiculação surge como uma abordagem promissora. Lipossomas são um exemplo de sistemas de veiculação amplamente usado, capazes de aumentar a estabilidade e a biodisponibilidade do agente encapsulado, promover a libertação lenta e controlada, protegê-lo da degradação e reduzir a sua toxicidade. Assim, a fim de direcionar os lipossomas para a BHE, foi empregue um sistema de veiculação consistindo em lipossomas carregados com MH, funcionalizados com um anticorpo para o recetor da transferrina (TfRAb), que é altamente expresso nas CEME. Para este projeto, colocámos a hipótese de que a entrega direcionada de MH, por via lipossomal, pode evitar a rutura da BHE induzida pelas CCM, preservando as suas propriedades e, deste modo, prevenir a formação de metástases encefálicas. Com este trabalho, o nosso objetivo foi não só desenvolver e caracterizar uma formulação lipossomal, encapsulando a MH e direcionada para as CEME, como também avaliar a sua segurança relativamente à integridade da BHE. Além disso, propusemo-nos também a avaliar o potencial deste tratamento para evitar a disrupção da proteína de junção β-catenina, diminuir a sobreexpressão endotelial da MMP-9 induzida pelas CCM e impedir a adesão das mesmas ao endotélio encefálico. A nanoformulação lipossomal foi desenvolvida utilizando o método de hidratação do filme lipídico e o método deremoteloadingpara a encapsulação da MH. Para a incorporação do TfRAb (em particular o RI7-217, abreviadamente Ri7) à superfície, usou-se o método da pós-inserção, onde a ligação do Ri7 é feita em micelas lipidicas que são posteriormente incorporadas na bicamada do lipossoma preformado. A formulação carregada com MH e funcionalizada com o Ri7 (denominada Ri7-MH-Lip) foi caracterizada quanto aos seus parâmetros físico-químicos como o tamanho, índice de polidispersão e carga de superfície, apresentando um tamanho médio de 140 nm, com carga superficial neutra e um ótimo índice de polidispersão, o que indica homogeneidade entre a populaçãolipossomal. Foi também determinada aeficiênciado sistema em encapsular a MH e incorporar o Ri7, tendo-se observado altas eficiências para ambos os parâmetros. Os ensaios de segurança e associação celular foram realizados num modelo in vitro melhorado da BHE utilizando uma linha celular de endotelioma cerebral de ratinho b.End5. De modo a mimetizar as condições fisiológicas, as células foram expostas a condições de shear stress (por agitação orbital). O efeito do Ri7 à superfície dos lipossomas na associação às CEME foi avaliado porcitometriade fluxo, tendo-se observado um aumentao da associação e, consequentemente da internalização celular, a tempos curtos de incubação. Além disso, verificou-se também uma maior associação celular aliado ao aumento do tempo de incubação. De seguida, com o intuito de assegurar a segurança do tratamento, avaliou-se a toxicidade para as b.End5, bem como dois indicadores importantes da integridade da BHE: a resistência elétrica transendotelial e a permeabilidade da monocamada. O tratamento com Ri7-MH-Lip não comprometeu a viabilidade celular, às concentrações escolhidas, nem prejudicou a integridade da barreira, mostrando ser seguro para as CEME. Com o objetivo de avaliar o efeito do tratamento com Ri7-MH-Lip na expressão e localização da proteína de junção β-catenina e da MMP-9, bem como a adesão de CCM à monocamada endotelial, foi empregue um modelo simplificado de metástases encefálicas do CM. Este modelo tem por base culturas mistas de células b.End5, também sob shear stress, e CCM triplo-negativo de ratinho 4T1, previamente marcadas (comCellTracker) para permitir distinção entre as duas populações por imunofluorescência. Os resultados da análise da expressão da β-catenina evidenciaram a disrupção da BHE que é provocada pelo contacto com as células tumorais, passando por perda de β-catenina ao nível da membrana e abertura de buracos na monocamada endotelial. A exposição à formulação revelou o grande potencial deste tratamento em evitar tanto a perda de β-catenina membranar, bem como a integridade da monocamada.Os resultados relativos à expressão da MMP-9 mostraram uma sobreexpressão endotelial desta enzima aquando do contacto com as CCM. Estas observações vão de encontro com o esperado tendo em conta que a MMP-9 está implicada na degradação da matriz extracelular e no aumento da permeabilidade vascular. Desta forma, o tratamento com Ri7-MH-Lip mostrou ser capaz de regular eficazmente a expressão da enzima, reduzindo-a para os níveis do controlo, em cultura simples, validando o potencial deste tratamento para impedir o extravasamento de CCM. Tendo visto o efeito deste tratamento na prevenção da disrupção da BHE, foi-se avaliar outro passo fundamental para o extravasamento: a adesão das células tumorais às CEME. Para tal, procedeu-se à contagem de células 4T1 aderentes à monocamada endotelial. O resultado do tratamento com Ri7-MH-Lip demonstrou dificultar a adesão das células 4T1, indicado por uma redução significativa do número de células tumorais aderidas, quando comparado ao controlo. Em suma, com a realização deste trabalho foi possível desenvolver e caracterizar uma nova nano formulação lipossomal, bem como demonstrar o seu elevado potencial para preservar a integridade da BHE e impedir a adesão de CCM como passo fulcral do extravasamento. É de salientar que a MH é um fármaco já usado na prática clínica o que facilita e acelera o processo de reaproveitamento para outro fim, nomeadamente para a prevenção de metástases encefálicas do CM. Este trabalho contribui para o avanço científico na área da neuroncologia ao abordar, de forma inovadora e preventiva, o real desafio que são as metástases encefálicas do CM.Breast cancer (BC) is the most commonly diagnosed cancer in women, with over 2 million new cases worldwide in 2020. An alarming concern of BC is the metastatic stage, responsible for most BC-related deaths. Among the different subtypes, triple-negative BC is the most aggressive and fastest to develop brain metastases, that leaves patients with limited treatment options leading to extremely low survival rates. To metastasize to the brain, BC cells (BCCs) encounter the blood-brain barrier (BBB), a highly specialized structure, characterized by presence of elaborate junctional complexes that limit the transport of most compounds into the brain. Despite being a greatly impermeable barrier, circulating BCCs can adhere, disrupt, and transpose, resulting in brain metastases. We recently screened a library of molecules for their ability to prevent BBB disruption and triple-negative BCCs’ trafficking, identifying minocycline hydrochloride (MH), a clinically used antibiotic, as the best candidate for further studies. To minimize side effects and assure a specific BBB-delivery, a Trojan horse drug carrier approach targeting the transferrin receptor (TfR), which is highly expressed on brain microvascular endothelial cells (BMEC), appears as a promising strategy. In that sense, we hypothesized that liposomal targeted delivery of MH can counteract BCC-induced BBB disruption by improving barrier properties and prevent BC brain metastases formation. Thus, we aimed to develop and characterize an innovative nanotechnological system encapsulating MH, for BBB-targeting with an anti-TfR antibody (TfRAb, particularly Ri7), as well as assess its safety regarding BBB integrity. Furthermore, we also aimed to evaluate this treatment’s potential to avoid BCC-induced BBB junctional protein disruption and metalloproteinase-9 (MMP-9) overexpression as well as BCC adhesion. The nanotechnological delivery system consisting of MH-loaded liposomes conjugated with Ri7 (in short, Ri7-MH-Lip) was developed, and physico-chemical parameters were determined to characterize this system. Biological safety and cellular association assays were performed on a simplified BBB in vitro model with a brain endothelioma cell line b.End5, encompassing shear stress to closely mimic the in vivo conditions. Moreover, to assess Ri7-MH-Lip’s effect on the junctional protein β-catenin, MMP-9 and BCC adhesion to the endothelial monolayer, a simplified BC brain metastases model relying on mixed cultures of b.End5 cells, under shear stress, and CellTracker-labelled triple-negative BCC line 4T1 was employed. The developed Ri7-MH-Lip presented an average size of 140 nm, with optimal polydispersity index and neutral surface charge. In addition, high MH encapsulation and good Ri7 incorporation efficiency was achieved. Ri7 trojan horse biological effect on BMECs’ liposomal uptake revealed increasing cellular association and uptake in a time- dependent manner. Cellular toxicity and barrier integrity assays were carried out, revealing no safety concerns for barrier properties. Additionally, Ri7-MH-Lip treatment significantly reduced BCC-induced junctional protein b-catenin’s disruption and increased the expression at the membrane level in both mixed and single cultures. Endothelial MMP-9 overexpression was observed in contact with BCCs and was thereby reduced to single culture levels upon treatment with Ri7-MH-Lip. Moreover, tumour cell adhesion was hampered in treated conditions demonstrated by a decrease in the number of cells adhered to the endothelial monolayer. Altogether, our results highly support the potential of the developed Ri7-MH-Lip treatment to preserve the BBB and hinder BCC extravasation, paving the way for MH repurposing for BC brain metastases prevention.The studies presented in this master thesis were performed in the research groups “Neurovascular Lab” and “Advanced Technologies for Drug Delivery Lab”, from the Research Institute for Medicines (iMed.ULisboa), Faculty of Pharmacy, Universidade de Lisboa, under the supervision of Professor Doctor Maria Alexandra Brito and co- supervision of Doctor Manuela Colla Carvalheiro. All presented images of immunofluorescence were acquired at the Faculty of Sciences of the University of Lisbon’s Microscopy Facility, a node of the Portuguese Platform for BioImaging, reference PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122, under collaboration with Professor Rui Malhó and Doctor Hugo Botelho.Brito, Maria AlexandraCarvalheiro, Manuela CollaRepositório da Universidade de LisboaSilvestre, Rafaela Flauzino2022-02-212022-02-282025-02-21T00:00:00Z2022-02-21T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/54597TID:203015584enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T17:01:03Zoai:repositorio.ul.pt:10451/54597Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:05:23.638522Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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