Gene delivery to neural stem cells using minicircles and plasmids without CpG motifs
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| Data de Publicação: | 2011 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/6386 |
Resumo: | Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011 |
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Gene delivery to neural stem cells using minicircles and plasmids without CpG motifsCélulas estaminaisTerapia genéticaTeses de mestrado - 2011Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011Neural Stem Cells (NSC) are multipotent stem cells, capable of proliferating and differentiating in vivo and in vitro into astrocytes, oligodendrocytes and neurons. For this reason they hold a great potential for the development of gene and regenerative therapies for the treatment of neurodegenerative diseases and brain cancer. However, transfection of NSCs has proven to be difficult through conventional methods, and the disadvantages associated with the use of viral vectors make non-viral vectors more suitable for the development of gene delivery assays to NSCs. Apart from the non-viral method, one of the most important factors in gene delivery is the type of used vector. One of the factors that mostly affect the vector efficiency is the presence of CpG motifs. These motifs are responsible for the triggering of innate and acquired immune responses contributing to episomal silencing of the transgene. In this study, gene delivery to NSCs was optimized for the use of microporation technology and transfection efficiency was compared for the use of different transfection vectors with low vs. high CpG content, namely, minicircles, pCMV-GFP and pVAX-eGFP. The optimization of microporation conditions revealed that depending on the electroporation buffer, high number of transfected cells (60 to 75%) and low cell mortality (15-10%) are obtained when using 1500V, 20 ms and 1 pulse or 1800V, 20 ms and 1 pulse as microporation conditions. When comparing the transfection efficiency using different vectors it was evident that Minicircle was the vector that allowed the obtainment of sustained and higher number of transfected cells (75%) without affecting their survival (80-90% of cell viability) and morphology. The quantification of vector copies in the nuclei revealed that the optimal dose to transfect NSCs is around 0.8 μg, and that, although a similar number of Minicircle and pCMV-GFP copies per nucleus is found, the first are the vectors that yield the highest expression levels. Long term analysis also showed Minicircles are less degraded, exhibiting higher number of copies and GFP expression than pCMV-GFP or pVAX-eGFP. Finally, microporation did not seem to affect NSCs differentiation potential. Taken together, these results offer the first insights in the use of microporation and minicircles in non-viral transfection of NSCs, suggesting that microporation is a promising tool for NSCs transfection and that minicircles offer a new model of efficient and safe non-viral gene delivery to NSCs and have unquestionably a potential use for clinical applications and genetic engineering.Células estaminais representam um grupo específico de células indiferenciadas que apresentam a capacidade de se auto-renovar e de se diferenciar, quando estimuladas por determinadas condições, em células várias linhagens distintas. Existem dois tipos distintos de células estaminais: embrionárias e adultas. As células embrionárias apresentam a capacidade de se especificarem em vários tipos celulares no entanto, os problemas éticos muitas vezes associados com o seu isolamento e potencial cancerígeno, limitam o seu uso. Por este motivo, o interesse em células estaminais adultas, que apresentam apenas a capacidade de se especificar em tipos celulares provenientes do seu tecido de origem, tem vindo a aumentar exponencialmente. Células estaminais neurais (Neural stem cells – NSC) representam uma população de células que pode ser isolada a partir de tecido cerebral embrionário, fetal ou adulto. No cérebro em desenvolvimento estas células existem como progenitores neuroepiteliais que se diferenciam em vários progenitores neurais que vão dar origem aos três tipos celulares característicos do sistema nervoso, astrócitos, oligodendrócitos e neurónios. No sistema nervoso adulto, estas células representam uma população de astrócitos que têm a capacidade de se diferenciar em caso de infecção ou inflamação, e habitam nichos específicos na zona subventricular do prosencéfalo e na zona subgranular do hipocampo. A sua capacidade única de se diferenciarem em células do sistema nervoso e de, após enxerto, conseguirem ultrapassar a barreira hematoencefálica, faz com que estas células apresentem um elevado potencial para o desenvolvimento de terapias regenerativas e genéticas para o tratamento de doenças neurodegenerativas e de cancro do cérebro. Em cultura, estas células são aderentes ou formam complexos esféricos de progenitores neurais, apresentam a forma bipolar e expressam factores característicos de células neuronais, tais como nestina, Sox2 e Pax6, e astrogliais, tais como GFAP, GLAST, BLBP e RC2. A capacidade de diferenciação que estas células apresentam e o desenvolvimento de protocolos de diferenciação simples e eficazes fez com que as NSCs tenham sido alvo de diversos estudos de regeneração de tecidos e transferência de genes. Estudos recentes demonstraram que em caso de enxerto, as NSCs conseguem diferenciar-se em neurónios dopaminérgicos e substituir lesões em modelos de doença de Parkinson e conseguem reduzir o processo inflamatório em modelos de esclerose múltipla. Em termos de entrega de genes, os estudos efectuados demonstraram que as NSCs podem ser transfectadas e entregar genes terapêuticos que potenciam o melhoramento de várias doenças de foro neurológico. Um dos grandes problemas até agora tem sido o desenvolvimento de métodos de transfecção eficientes. Até muito recentemente, a transfecção de NSCs era basicamente feita através de métodos virais, no entanto os problemas patogénicos associados a estes vectores e a possibilidade de indução de mutagénese das células transfectadas fez com que a atenção dos cientistas divergisse para as metodologias não virais. Em comparação com as primeiras, estas metodologias oferecem uma série de vantagens, tais como, maior capacidade de empacotamento, menor imunogenicidade, fácil e maior segurança de manuseamento. A entrega de genes usando estes métodos pode ser feita através de tratamentos químicos, como partículas de fosfato de cálcio, biopolímeros biodegradáveis e liposomas catiónicos, e através de tratamentos físicos, tais como sonoporação, bombardeamento de partículas, magnetofecção, electroporação e microporação. Para além do método de transfecção, há que ter em atenção o tipo de vector usado. Após transfecção, os vectores têm que ultrapassar barreiras extra e intracelulares que causam silenciamento episomal do transgene. É por este motivo que têm sido desenvolvidos muitos trabalhos com o intuito de melhorar os vectores. Um dos factores que mais afecta a eficiência de um plasmídeo é o conteúdo deste em motivos CpG. Estes dinucleótidos não-metilados são característicos de genomas bacterianos e, se presentes em plasmídos, são reconhecidos pelo sistema imunitário de mamíferos, mais especificamente por células que expressam TLR9, despoletando reacções imunológicas inatas e secundárias que levam à degradação do vector e posterior silenciamento do transgene. Recentemente têm sido produzidos plasmídeos de conteúdo reduzido em motivos CpG que em relação aos pDNAs convencionais, apresentam eficiência e persistência melhoradas. Para além destes tipos de vectores, o desenvolvimento da tecnologia de minicirculos, que são pequenos vectores desprovidos de sequências bacterianas e de conteúdo CpG reduzido, permitiu um melhoramento de 10 a 10,000x das eficiências de transfecção em relação aos pDNAs convencionais. O objectivo principal deste estudo foi a optimização das condições de transfecção não viral de NSCs (CGR8-NSC) por microporação e a comparação das eficiencias de transfecção de NSCs quando transfectadas com minicirculos e pDNAs com conteúdo em motivos CpG reduzido ou mesmo inexistente. Neste estudo, foram feitas duas optimizações das condições de microporação para o uso de dois tampões de electroporação diferentes, o RB, um tampão de formulação desconhecida, e o HMB, um tampão preparado no laboratório e que já tinha sido utilizado para transfectar células HEK293T e células estaminais mesenquimatosas. A microporação com o tampão RB foi feita transfectando pVAX-eGFP e variando a voltagem (entre 1400 e 1600V), a duração do pulso (20 e 30 ms) e o número de pulsos (1 e 2). A condição que no geral demonstrou ser mais eficaz foi 1500V, 20 ms e 1 pulso (percentagem de células transfectadas ≈ 60%; viabilidade e recuperação celular 85-90%). A optimização com HMB foi feita microporando as NSCs com dois vectores diferentes (pVAX-eGFP e MC-GFP) e variando a voltagem entre 1600 e 1900V. Apesar de, com o aumento da voltagem se ter verificado, em ambos os casos, uma diminuição das viabilidades e recuperações celulares (mais acentuada em células transfectadas com pVAX-eGFP), no geral, a condição que obteve os melhores resultados, exibindo as percentagens de células transfectadas (50 e 75% com pVAX-eGFP e PC-GFP) e rendimentos de transfecção (47 e 69% com pVAX-eGFP e MC-GFP) mais elevadas foi 1800V, 20 ms e 1 pulso. Um outro ensaio de optimização foi efectuado para determinar a quantidade ideal de DNA para transfectar NSCs. Para isto, NSCs foram ressuspendidas em RB e transfectadas com várias quantidades de pVAx-eGFP (0.5, 0.8, 1.0 e 1.5 μg) usando 1500V, 20 ms e 1 pulso como condições de microporação. Apesar de o aumento de DNA não ter afectado a percentagem de células GFP+ (≈50%) e de ter provocado uma diminuição das viabilidades e recuperações celulares, 0.8 μg foi a quantidade de pDNA que exibiu o maior rendimento de transfecção (≈40%), tendo sido por isso considerada a quantidade ideal de vector para transfectar NSCs. Para testar a eficiência de transfecção de minicirculos e outros pDNAs com conteúdo reduzido ou inexistente em CpGs as NSCs foram transfectadas com 2.0 x 1011 moléculas de cada vector. A transfecção com plasmídeos sem motivos CpG (pCpGfree-eGFP) revelou-se muito aquém do esperado, e quando comparando com NSCs transfectadas com pVAX-eGFP, a percentagem de células GFP+ era menor e o decaimento da expressão do transgene ao longo do tempo mais rápido em células transfectadas com pCpG-eGFP, indicando que talvez, o promotor deste plasmídeo não seja tão eficiente como o do pVAX-eGFP. Comparando células transfectadas com minicirculos (MC-GFP) com outros pDNAs (pCMV-GFP – plasmídeo correspondente de MC-GFP, e pVAX-eGFP) verificou-se que usando MC-GFP é possível manter elevados níveis de células transfectadas (≈75%) sem comprometer a viabilidade celular (80-90%) e a morfologia bipolar característica das NSCs em cultura. Adicionalmente, a expressão do gene mantém-se mais alta com MC-GFP ao longo de 10 dias e não afecta a proliferação celular. Testes adicionais foram efectuados para quantificar o número de cópias de vector no núcleo de NSCs transfectadas. Em estudos anteriores tinha-se verificado que há uma certa dose de plasmídeo a partir do qual a expressão do transgene satura. Em NSCs verificou-se que, independente do vector, a partir de 0.8 μg há uma estabilização e posterior decaimento da expressão da GFP, e, quando comparando o número de cópias de cada vector no núcleo, verificou-se que apesar da quantidade de MC-GFP e pCMV-GFP ser semelhante, o nível de expressão do primeiro era mais elevado. Adicionalmente, a análise ao longo de 10 dias da quantidade de cópias do núcleo revelou que o MC-GFP era o vector que se encontrava em maior quantidade no núcleo e o que revelava maiores níveis de expressão do transgene, indicando que este, devido ao seu menor tamanho e conteúdo CpG mais reduzido (≈6%) é menos degradado que os outros plasmídeos. Em comparação, os resultados com pCMV-GFP e pVAX-eGFP, que apresentam conteúdo semelhante em motivos CpG (≈7%), diferem muito entre si, apresentando o pCMV-GFP eficiências e viabilidades celulares mais elevadas. Este facto é difícil de ser explicado mas há três diferenças entre estes dois plasmideos que podem justificar esses valores: i) diferente sinal de poliadenilação dos dois plasmídeos (pVAX-eGFP apresenta o sinal BGH e o pCMV-GFP apresenta o sinal SV40), que como estudos anteriores já demonstraram pode influenciar os níveis de expressão, ii) diferenças na sequência do gene reporter que pode originar uma proteína com maior ou menor intensidade de fluorescência; iii) ou ao nível de purificação de cada plasmídeo. Finalmente, nem o uso de microporação nem a transfecção com plasmídeo afectou a capacidade de diferenciação das NSCs em neurónios. Comparando os resultados obtidos é possível concluir que o uso de microporação como método de transfecção de NSCs dá origem a elevadas eficiências de transfecção. Em comparação com os outros pDNAs, os Minicirculos foram os vectores que demonstraram as melhores eficiências de transfecção e os maiores níveis de expressão do transgene sem comprometer a morfologia e a viabilidade das células. Pode-se concluir que o tamanho destes vectores e que a diferença e 1% no conteúdo em motivos CpG é suficiente para que o silenciamento episomal do transgene seja mais fraco com MC-GFP. Como trabalho futuro, seria interessante avaliar a expressão de TLR9 em NSCs após transfecção para verificar se há realmente silenciamento devido aos motivos CpG e quantificar o RNA mensageiro para avaliar a estabilidade e frequência do transgene. Seria também muito benéfico avaliar a eficiência dos minicirculos através de transfecção por outros métodos não virais, tais como, lipofecção ou magnetofecção, e efectuar estudos in vivo para avaliar o tráfico intracelular de minicirculos, e também clonar um gene de interesse nos minicirculos para avaliar o seu potencial no desenvolvimento de futuras terapias para doenças de foro neurológico. Até à data, ainda não tinham sido efectuados estudos de transfecção em NSCs usando microporação ou minicirculos. Este trabalho representa a primeira perspectiva para o uso destas tecnologias para a transfecção destas células e indica que os minicirculos representam um novo modelo eficiente e seguro de entrega não viral de genes para NSCs e uma alternativa muito promissora para o desenvolvimento de terapias para o tratamento de doenças neurodegenerativas ou cancro do cérebro onde uma expressão transiente de transgene pode ser necessária.Madeira, Teresa Catarina PáscoaSerrazina, Susana Maria Traquete, 1972-Repositório da Universidade de LisboaReis, Mónica Sofia Correia dos, 1986-2012-05-29T16:29:56Z20112011-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/6386enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:48:53Zoai:repositorio.ul.pt:10451/6386Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:31:32.440302Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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