Correction of sickle-cell anemia using CRISPR-Cas9 system in hematopoietic stem cells

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Draiblate, Beatriz Lopes
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/46527
Resumo: Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2020
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spelling Correction of sickle-cell anemia using CRISPR-Cas9 system in hematopoietic stem cellsSickle cell anemiaHematopoietic stem cellsHaemoglobinCRISPRInduced pluripotent stem cellsBiologia MolecularDomínio/Área Científica::Ciências MédicasTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2020Drepranocitosis (or sickle cell anemia - SCA) is a genetic hereditary disease that affects millions of people worldwide, bearing significant clinical features and a compromised prognosis with increased recurrences of crisis. Many treatments have been suggested to help dealing with sickle cell anemia, either by reducing and managing the consequences of the disease, or even by trying to solve it (bone marrow transplant). However, until date, there has not been developed a “perfect” therapeutic approach. Gene therapy has been used as the ultimate weapon to treat diseases whose cure cannot be achieved with traditional methods. CRISPR-Cas9 showed to be potentially safer and more efficient in treating SCD than other conventional gene therapies, which is presumed to be a result of the precision of the correction of this tool and the lack of use of viral vectors. Comparing with other available gene-editing techniques, namely zinc finger nucleases (ZFNs) and transcriptional activator-like effector nucleases (TALENs), CRISPR/Cas9 offers some advantages, as well as some limitations and complications. Overcoming these challenges and issues concerning the delivery of such tools to hematopoietic stem cells (HSCs) conserving their engrafting ability, may open the way to available curative approaches for SCD and other hemoglobinopathiesA drepanocitose (ou anemia falciforme) é uma doença genética hereditária que afeta milhões de pessoas em todo o mundo, sendo mais frequente em famílias com ascendência africana. Esta anemia é causada por uma mutação pontual no sexto codão da β-globina que leva à substituição de um ácido glutâmico por uma valina. Tal mutação é responsável pela alteração da forma da hemáciaepela alteração da hemoglobina. Consequentemente, esta torna-se menos solúvel em água e forma precipitados fibrosos, obtendo uma conformação de foice. Esta fragilidade faz com que as hemácias sofram lise com frequência na corrente sanguínea, diminuindo a sua concentração. A hemoglobina é uma proteína tetramétrica composta por dois pares de cadeias de globina, cada uma com o seu grupo heme. Hemácias normais de adultos possuem, maioritariamente, HbA (α2β2), juntamente com pequenas quantidades de HbA2(α2δ2) e hemoglobina fetal (HbF;α2γ2). Cerca de 2 milhões de indivíduos são heterozigóticos para HbS, constituindo uma condição assintomática. Indivíduos homozigóticos para HbS produzem sintomas da anemia falciforme. Nestes indivíduos, quase toda a hemoglobina é HbS. São as propriedades químico-fisiológicas anormais da hemoglobina (HbS –“sickle”) as responsáveis pela doença. A clínica desta patologia inclui crises anemia hemolítica, reticulócitos, e crises vaso-oclusivas, que podem levar a isquémia dos tecidos onde ocorrem. Um aumento do número de crises que necessitem de hospitalização estão associadas a um pior prognóstico e a uma redução da sobrevida, provavelmente devido a lesão crónica de órgãos. A anemia falciforme é endémica nalgumas áreas geográficas, nomeadamente na África Subsariana, devido à sua proteção relativa contra a malária. Anualmente, cerca de 300000 crianças nascem com esta patologia, com uma mortalidade entre 75-90% até aos 5 anos, principalmente devido a doenças infeciosas. É importante salientar que esta proteção relativa contra a malária apenas se verifica em indivíduos heterozigóticos (pois a falciformização das células facilita a sua remoção da circulação sanguínea pelos macrófagos), enquanto que indivíduos homozigóticos estão mais suscetíveis a consequências letais, por exemplo, pela exacerbação da anemia hemolítica e pela reduzida remoção de parasitas (consequência do hiposplenismo funcional). Os tratamentos para esta anemia, atualmente, incluem antibióticos (como a profilaxia com penicilina), vacinação contra Streptococcus pneumoniae, transplante de medula óssea, transfusões de sangue e alguns fármacos que auxiliam no controlo sintomático da doença. A hidroxiureia tem vindo a ser desenvolvida, a qual parece estimular a produção de hemoglobina fetal, prevenindo que as hemácias obtenham a forma de foice. Ao aumentar a concentração de hemoglobina fetal (HbF), que interfere com a formação de HbS, reduz a falciformização das hemácias. Além disso, reduz a inflamação crónica ao diminuir a contagem de neutrófilos. Atualmente, parece ser o melhor tratamento disponível para esta doença. As primeiras técnicas de edição genómica baseavam-se em sistema guiados por proteínas, como os Zinc Finger (ZFNs) e os TALENs (Transcription Activator-Like Effector nucleases). Estas nucleases contêm domínios específicos de ligação a sequências DNA alvo, ligados a um domínio de clivagem de DNA não-específico, o qual induz quebras duplas de cadeias na sequência alvo. As quebras duplas de cadeias são, então, reparadas através de mecanismos de reparação do DNA, estimulando, por exemplo, a recombinação homóloga entre um cromossoma “terapêutico” de DNA e o cromossoma alvo. Recentemente, um novo mecanismo de edição de genoma, o sistema CRISPR/Cas, emergiu como uma alternativa para o tratamento de desordens genéticas. Este sistema usa uma DNA endonuclease guiada por um RNA guia para induzir quebras duplas de cadeias, produzindo o mesmo efeito que as nucleases ZNFs e TALENs, mas possuindo outras vantagens. Ao ser um sistema guiado por RNA, torna-se mais fácil projetar devido à possibilidade de usar uma molécula de RNA complementar ao local preciso de edição genómica, guiando a clivagem. Esta técnica, assim, constitui uma alternativa mais rápida e eficiente que sistemas de edição de genomas guiados por proteínas. Os principais riscos associados às terapias de edição genómica associam-se à possibilidade de ocorrência de mutagénese, caso o gene terapêutico seja inserido noutra parte do genoma diferente do alvo, levando à disrupção do normal funcionamento da célula ao mutar outro gene wild-type. Outro problema associado é o risco de resposta imunes contra os vetores, principalmente se administrados in vivo. Durante décadas, doenças hematológicas como a talassémia e a anemia falciforme têm sido alvo de terapias de edição genómica. No entanto, devido à complexidade da regulação da expressão do gene da globina (devido ao splicing alternativo e à importância dos intrões na regulação deste gene), a utilização destas técnicas tem sido um desafio. Ensaios clínicos de terapia de edição genómica em células estaminais em doentes com talassémia mostraram resultados promissores, com uma correlação entre a eficácia clínica e a eficácia de transferência de genes. Neste trabalho, descrevem-se métodos e resultados alcançados em trabalhos que objetivaram corrigir a mutação causadora da anemia falciforme recorrendo à técnica de CRISPR-Cas9. Sumariamente, procedeu-se à construção de um plasmídeo que contivessea nuclease Cas9 e um RNA guia complementar ao intrão 2 do gene da β-globina HbSe à construção de um vetor dador (terapêutico) que transportava a sequência codificante wild-type do gene da β-globina HbS, flanqueada por dois braços de homologia que irão ter como alvo o intrão 2 do gene. De seguida, procedeu-se à avaliação da eficiência de corte. Após se proceder à cotransfeção para células progenitoras/estaminais hematopoiéticas CD34 + (HSPCs) destes vetores, procedeu-se à avaliação da eficiência desta abordagem, através de técnicas como genotipagem por PCR. Procedeu-se à diferenciação de HSPCs derivadas de pacientes com anemia falciforme em eritrócitos, seguindo-se testes para avaliar a falciformização, mostrando que estas células não eram tão sensíveis à hipoxia e que não adquiriam aforma de foice, contrastando com o controlo de células homozigóticas para HbS. Estes trabalhos mostraram que a utilização da técnica de CRISPR-Cas9 em HSPCs humanas possibilita a correção da mutação HbS (pelo menos num dos alelos), pelo que este método poderá ser utilizado como possível terapia para esta doença. Estudos que utilizaram modelos animais, nomeadamente ratinhos portadores da mutação HbS, mostraram que não só é possível realizara correção da mutação utilizando CRISPR-Cas9, como também que esta técnica parece ser potencialmente mais segura e eficiente comparando com outras técnicas de edição genómica, presumivelmente devido à precisão da correção e ao facto de não recorrer ao uso de vetores virais. Embora existam outras vantagens associadas a esta técnica(como a simplicidade e a facilidade de criação de gRNAs), várias são, também, as limitações que ainda hoje não se conseguiram ultrapassar (nomeadamente a ocorrência de eventos off-site, a baixa taxa de reparação de DNA pela via de reparação homóloga direta em células de mamíferos e a possibilidade de indução de β-talassémia). O futuro da utilização destas técnicas curativas para a anemia falciforme e outras hemoglobinopatias está dependente da capacidade de descobrir técnicas que nos permitam ultrapassar estes desafios e outros problemas relacionados com a entrega destas ferramentas às células hematopoiéticas. Globalmente, a incidência da anemia falciforme tem aumentado, com um foco importante em países como a Nigéria, a República Democrática do Congo e a Índia. Além de ter em conta o potencial que estes novos tratamentos oferecem aos pacientes, é igualmente importante ter noção do enquadramento geral. Nos locais onde a doença é mais prevalente (nomeadamente na África Subsariana), qualquer novo tratamento é praticamente inacessível. Estima-se que, para uma esperança media de vida de setenta anos para um doente com anemia falciforme, que o custo total associado à doença ronde os dez milhões de dólares. Com o aumento da sofisticação das técnicas utilizadas, há, também, um aumento do custo associado. Enquanto fármacos como a hidroxiureia acarretam um custo de aproximadamente 1000 dólares por ano (cerca de 70 000dólaresno total), o transplante de células estaminais e a terapia de edição genómica pode custar mais de 1 000 000 dólares. Embora se verifique uma diferença substancial de valores entre ambos os tratamentos, a terapia de edição genómica parece ser mais custo-efetiva, ao ser um tratamento único com potencial curativo.Martins, Sandra Cristina Bento PenisgaRepositório da Universidade de LisboaDraiblate, Beatriz Lopes2021-02-25T17:36:45Z2020-07-232020-07-23T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/46527TID:202620140enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:48:52Zoai:repositorio.ul.pt:10451/46527Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:58:41.064745Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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