Otimização do método para criopreservação de embriões de Drosophila Melanogaster

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Pereira, Ana Rita Gonçalves
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.21/16836
Resumo: Mestrado em Tecnologias Clínico-Laboratoriais
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spelling Otimização do método para criopreservação de embriões de Drosophila MelanogasterCriopreservaçãoVitrificaçãoD. melanogasterEmbriãoDesenvolvimento embrionárioCryopreservationVitrificationEmbryosEmbryonic developmentMestrado em Tecnologias Clínico-LaboratoriaisIntrodução: A manutenção de organismos-modelo, como a Drosophila melanogaster, é essencial para o desenvolvimento da investigação biomédica. Isso pode ser feito através de cruzamentos ou criopreservação. A criopreservação oferece vantagens, incluindo estabilização genética, redução de custos e prevenção de perda de stocks. No entanto, a criopreservação de insetos, como a Drosophila melanogaster, era desafiadora até recentemente. Um protocolo eficaz foi desenvolvido em 2021, tornando-se crucial, pois insetos são usados cada vez mais em investigação científica, incluindo manipulação genética. Isso é especialmente importante para centros de investigação e distribuição de stocks, impactando toda a comunidade científica. Objetivo específico: Otimizar a criopreservação de embriões de diferentes linhas de Drosophila melanogaster, incluindo linhas amplamente utilizadas e garantir a recuperação bem-sucedida de animais saudáveis após a descongelação. Material e métodos: Os embriões são recolhidos em placas de petri, a partir de uma garrafa avultada de moscas com idades entre ~4-5 dias. Vinte e duas horas depois (incubação a 20ºC), estes são descorionados e permeabilizados, passando de seguida ao processo de desidratação e entrada intra-embrionário do agende crioprotetor. Segue-se a congelação em azoto líquido provocando a congelação por vitrificação dos embriões. Para descongelação, estes são transferidos para sucrose e criotampão para a saída do CPA e transferidos para meio Schneider para posterior incubação. Resultados: Os resultados obtidos demonstraram a existência de uma percentagem muito reduzida de embriões desenvolvidos até estruturas larvais após descongelamento, nas três temperaturas testadas. No geral a percentagem de embriões desenvolvidos para larvas rondou entre 1,3 e 4,7%, enquanto a percentagem de larvas com locomoção/vivas rondou entre 1,2 e 2,7%. No que diz respeito a moscas eclodidas a partir das larvas vivas, as percentagens não foram além dos 0,1 e 0,2%. De um modo geral, os dados obtidos demostraram que a permeabilização dos embriões não foi eficiente, condicionado todo o restante processo de criopreservação. Conclusão: Os resultados indicam que a criopreservação de embriões de D. melanogaster é uma técnica desafiadora, requerendo adaptações às diferentes linhas genéticas e a fatores ambientais. A temperatura ambiente, entre 18-25°C, parece ser a ideal para a incubação pós-descongelamento, com melhores taxas de desenvolvimento larvar. No entanto, a maioria dos embriões não alcança o estágio larvar após o descongelamento nas três temperaturas testadas e menos de 1% chega a moscas eclodidas. Para melhorar o protocolo, é sugerido que a permeabilização adequada dos embriões no estádio de desenvolvimento correto seja crucial para o sucesso da vitrificação.ABSTRACT - Introduction: Model-organism maintenance, such as Drosophila melanogaster, is essential for the development of biomedical research. That maintenance can be done through crosses or cryopreservation. Cryopreservation offers advantages, including genetic stabilization, cost reduction, and prevention against the loss of stocks. However, insect cryopreservation, like Drosophila melanogaster, has been very challenging to achieve. Recently, in 2021, It was developed an effective protocol, which is vital to all researchers given the usage of this model in all scientific research, including genetic manipulation. This is very important for research centers and stock distribution, having an impact on the scientific community. Aim: Optimize embryo cryopreservation of different strains of Drosophila melanogaster, including strains widely used, and guarantee the successful revival of frozen embryos into healthy adult flies. Methods and materials: Embryos are harvested in petri dishes from flies 4-5 days old in a cage. Twenty-two hours later (incubation at 20ªC), embryos are dechorionated and permeabilized. After which cell dehydration and cryoprotective agent entrance begin. Afterward, embryos are frozen into Ln2 by vitrification. For thaw, embryos are transferred to a solution containing sucrose and a cryobuffer that leads to the release of CPA from the inside of the embryo. Embryos are then transferred to Schneider medium followed by incubation. Results: All the results obtained show a very small percentage of developed embryos that into larval structures after thawing, in all three different temperatures tested. In general, the percentages of embryos that developed into larvae are between 1,3% and 4,7%, Although percentages of live larvae were between 1,2% and 2,7%. When considering hatched flies that came from alive larvae (after thawing) the percentages were around 0,1% and 0,2%. These results showed that embryo permeabilization was not effective, conditioning all the cryopreservation process. Conclusion: Results show that D. melanogaster embryo cryopreservation is a very defiant technique, requiring adaptations to different strains and also ambiental factors. Room temperature between 18-25º seems to be ideal for incubation after thawing, with better results on the larvae development. However, most of the embryos do not reach the larval stage after thawing, in all three different temperatures tested and less than 1% reach the adult fly. To improve the protocol, it is suggested that an efficient permeabilization of embryos in the correct embryo stage is crucial for vitrification success.Instituto Politécnico de Lisboa, Escola Superior de Tecnologia da Saúde de LisboaRibeiro, EdnaCampos, Isabel Dantas deRCIPLPereira, Ana Rita Gonçalves2024-01-10T09:12:01Z2023-092023-09-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.21/16836TID:203400917porPereira AR. Otimização do método para criopreservação de embriões de Drosophila Melanogaster [dissertation]. 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