Identification and characterization of Internal Ribosome Entry Sites (IRES) in cancer pathways

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Neves, Ana Rita Rodrigues
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/33871
Resumo: Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018
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spelling Identification and characterization of Internal Ribosome Entry Sites (IRES) in cancer pathwaysTradução independente do capLocal de entrada interno do ribossoma (IRES)CancroΔ160p53p14H-RasTeses de mestrado - 2018Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências QuímicasTese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018Em eucariotas, a informação genética está codificada na molécula de ácido desoxirribonucleico (DNA, do inglês deoxyribonucleic acid), sendo transcrita para ácido ribonucleico mensageiro prematuro (pre-mRNA, do inglês premature ribonucleic acid), num processo denominado transcrição, e posteriormente traduzida para proteína, num processo designado tradução. Durante a transcrição, a molécula de pre-mRNA sofre um processo de maturação durante o qual lhe são adicionadas uma estrutura cap (guanina metilada, m7G) na extremidade 5’, e uma cadeia de poliadenosinas [cauda poli(A)] na extremidade 3’, e num fenómeno designado por splicing, se dá a remoção das regiões não codificantes (intrões) que intercalam com regiões codificantes/regulatórias (exões), e a junção das últimas. Seguidamente, o mRNA maduro é translocado para o citoplasma onde é traduzido para proteína nos ribossomas. A tradução implica, normalmente, o reconhecimento da estrutura cap por factores de iniciação da tradução (eIF, do inglês eukaryotic translation initiation factor). Após este reconhecimento, o complexo de preiniciação da tradução 43 S (43S PIC, do inglês 43S preinitiation complex), que depende da formação prévia do complexo ternário [factor eucariótico de iniciação da tradução 2 (eIF2, do inglês eukaryotic translation initiation factor 2) ligado a uma guanosina trifosfato (GTP, do inglês guanosine triphosphate) e à molécula de RNA de transferência (tRNA, do inglês transfer ribonucleic acid) que transporta a primeira metionina da cadeia peptídica (Met-tRNAi, do inglês initiator tRNA methionine complex)], é recrutado para a extremidade 5’ do mRNA, de onde iniciará o rastreamento da região 5’ transcrita mas não traduzida do mRNA (5’UTR, do inglês 5’untranslated region), até que este reconheça um codão de iniciação num contexto favorável. Quando um codão de iniciação é reconhecido, inicia-se a fase de alogamento da tradução, que consiste na síntese de uma cadeia peptídica. A terminação da tradução ocorre quando um codão stop é reconhecido pelo ribossoma, o que conduz à dissociação da recentemente formada cadeia peptídica do ribossoma e à reciclagem deste. Em condições de stresse, as células reduzem globalmente a síntese proteica sobretudo através da inibição da iniciação canónica da tradução. Esta inibição pode ser mediada, entre outras vias, pela fosforilação da subunidade alfa (α) do eIF2 (eIF2α), impedindo a sua reciclagem que é necessária para a formação de um novo complexo ternário, e consequentemente, do 43S PIC. A fosforilação do eIF2α é mediada por diferentes cinases em resposta a diferentes estímulos, designadamente stresse do retículo endoplasmático (RE), escassez de nutrientes e danos no DNA. Contudo, proteínas associadas à resposta ao stresse podem continuar a ser traduzidas usando mecanismos alternativos, permitindo às células redireccionar os seus esforços para combater o stresse. Algumas dessas proteínas são codificadas por mRNA que contêm regiões estruturadas designadas por locais de entrada internos do ribossoma (IRES, do inglês internal ribosome entry sites), que recrutam o ribossoma internamente para a vizinhança de codões de iniciação. A iniciação da tradução através destas estruturas requer muitas vezes a interacção com proteínas específicas, ITAF (do inglês, IRES trans-acting factor), e elimina a necessidade de reconhecimento da estrutura cap. A transformação de células normais em células tumorais ocorre devido a um acumular de mutações que conduz à inactivação ou à ativação de proteínas, ou ainda à alteração da sua actividade biológica. Muitas das proteínas que se encontram alteradas em cancro regulam vias essenciais ao crescimento e desenvolvimento de uma célula, e estão também associadas a programas de resposta ao stresse. Deste modo, e como seria expectável, são muitas as proteínas associadas ao cancro, cujos mRNA contêm IRES, permitindo, deste modo, a sua expressão em condições em que a tradução canónica está inibida. Este mecanismo de protecção celular, é explorado por células tumorais, que estão muitas vezes sujeitas a condições de stresse (escassez de oxigénio, escassez de nutrientes, ou danos no DNA), de forma a aumentar a sua capacidade de sobrevivência e proliferação. Este projecto teve por objectivo o estudo da expressão mediada por IRES de isoformas de proteínas que se encontram alteradas em diversos tipos de cancro: a isoforma Δ160p53 do supressor de tumores p53, que parece apresentar funções oncogénicas previamente associadas a mutações missense no gene TP53; e uma isoforma ainda não descrita do GTPase H-Ras, p14H-Ras, cuja expressão parece ser induzida em condições de stresse do RE a um nível bastante superior em relação à expressão da isoforma canónica do H-Ras (p21H-Ras). Recorrendo a uma análise in silico da estabilidade da região com possível actividade de IRES para cada um dos alvos, e de acordo com o conteúdo em GC e a energia mínima livre de Gibbs previstos, concluímos que ambos se tratavam de bons candidatos. Adicionalmente, pretendíamos avaliar o efeito de mutações associadas ao desenvolvimento de cancro no funcionamento deste mecanismo alternativo. Desta forma, usámos um vector bicistrónico que contém, como cistrão a 5’, a região codificante da luciferase da medusa Renilla reniformis (Rluc, do inglês Renilla luciferase), e, como cistrão a 3’, a região codificante da luciferase do pirilampo Photynus pyralis (Fluc, do inglês firefly luciferase). Deste modo, analisámos a expressão de cada uma das proteínas através da respectiva actividade de luciferase por medição directa da luminescência resultante de cada uma das reacções com o respectivo substrato. Este vector bicistrónico contém um hairpin (estrutura em grampo) estável a jusante do codão stop da Rluc, para impedir que o ribossoma reinicie a tradução após terminação da tradução canónica da Rluc, de maneira que a tradução da Fluc ocorrerá de forma independente da estrutura cap, e apenas na presença de estruturas no mRNA localizadas na vizinhança do respectivo codão de iniciação que permitam o recrutamento interno do ribossoma. As sequências em estudo para a actividade de IRES foram inseridas imediatamente a montante do codão de iniciação da Fluc e as mutações estudadas foram inseridas nesses mesmos constructos por mutagénese dirigida. A actividade de IRES foi estudada na ausência e na presença de thapsigargina, uma droga inibidora da bomba de cálcio do RE, que induz o stresse deste organelo, promovendo assim a inibição da tradução canónica por fosforilação do eIF2α. Relativamente ao estudo da expressão mediada por IRES do Δ160p53, observações anteriores indicaram que Δ160p53 contém um IRES nos primeiros 432 nucleótidos (nt) codificantes da isoforma Δ160p53, e que parte da região codificante de outra isoforma do p53, Δ133p53, localizada a montante do correspondente codão de iniciação do Δ160p53 (5’UTR do Δ160p53), inibe a actividade de IRES. Usando o sistema bicistrónico descrito anteriormente, analisámos a actividade de IRES dos 432 nt do Δ160p53 e a sua inibição por parte da respectiva 5’UTR. No constructo bicistrónico que contém os 432 nt do Δ160p53 observámos um aumento (não estatisticamente significativo) na actividade de luciferase da Fluc, e que, na presença da 5’UTR, esta é inibida. Além disso, analisámos o efeito de três das mutações missense mais comuns do TP53 (R175H, R248Q e R273H) na actividade de IRES. De acordo com os nossos resultados, as mutações R248Q e R273H parecem induzir a actividade do IRES em condições de stresse do RE. Portanto, a função oncogénica destas mutações poderá estar relacionada com o aumento da expressão dependente de IRES do Δ160p53 em tecidos tumorais, promovendo a capacidade de proliferação, sobrevivência e invasão das células. Além de identificar IRES, pretendíamos caracterizá-los a nível da estrutura e da regulação. Deste modo, iniciámos o processo de optimização da caracterização in vivo da estrutura secundária do IRES do Δ160p53 através do método de modificação química de ácidos nucleicos usando o dimetilsulfato (DMS), bem como das condições de imunoprecipitação do Hdm2 (do inglês murine double minute 2 human homolog)⸺foi descrito como ITAF capaz de regular a expressão dependente de IRES do XIAP (do inglês X-linked inhibitor of apoptosis protein) e cuja interação com um IRES presente no mRNA do p53 foi observada⸺para identificar novos IRES regulados por esta ITAF através da sequenciação de RNA previamente co-immunoprecipitados usando anticorpos anti-Hdm2. Em diferentes condições de stresse, foi observado recentemente no nosso laboratório o aumento da expressão de uma isoforma ainda não descrita do GTPase H-Ras, p14H-Ras, indicando que um mecanismo de tradução alternativo poderá regular a sua expressão. Além disso, observou-se também que a presença da mutação silenciosa H27H (T81>C), associada a um maior risco de desenvolvimento de cancro, promovia o aumento da expressão de p14H-Ras em condições de stresse. Usando o mesmo sistema bicistrónico, analisámos a actividade de IRES de 195 nt da região codificante do p21H-Ras (região codificante limitada pelo codão de iniciação do p21H-Ras e pelo hipotético codão de initiação do p14H-Ras). Além disso, analisámos o efeito na actividade deste hipotético IRES da mutação silenciosa T81>C. Os nossos resultados sugerem que, em condições de stresse, esta região é capaz de mediar a tradução de forma independente da estrutura cap e que a mutação estimula a actividade de IRES. Um possível papel oncogénico desta mutação será promover a expressão desta isoforma, que, tal como Δ160p53, poderá apresentar funções oncogénicas. No futuro, pretendemos realizar um rastreio de drogas capazes de inibir a actividade dos IRES aqui estudados, e avaliar se estas poderão reverter o processo de tumorigénese. Além disso, pretendemos caracterizar a estrutura secundária de cada um destes IRES, identificar novos IRES e novas ITAF. Pretendemos, assim, identificar proteínas cuja expressão através de IRES possa estar implicada no desenvolvimento de cancro, e assim fornecer novas abordagens para a terapia desta doença.In eukaryotes, most proteins are translated through a canonical translation initiation mechanism that involves recognition of the cap structure at the messenger ribonucleic acid (mRNA) 5’end in order to recruit the ribosome. Yet, during certain physiological and pathological conditions, canonical translation is impaired and protein synthesis is globally decreased, in part due to eIF2α phosphorylation. However, some mRNA that encode, among others, proteins associated with stress-response are translated through alternative cap-independent translation initiation mechanisms. Internal ribosome entry sites (IRES) consist of structures within the mRNA that can recruit the ribosome to the vicinities of, or directly to, the initiation codon, in a cap-independent manner. Overall, IRES-dependent translation initiation does not require the complete set of eukaryotic translation initiation factors (eIF) for ribosomal recruitment but additional factors named IRES trans-acting factors (ITAF) are required to modulate the IRES activity. Several cellular mRNA-containing IRES are related to stress-response, programmed cell death, cell proliferation, cell growth and angiogenesis, and their deregulation has been associated with tumor development. Nonetheless, IRES-mediated translation mechanisms are not well understood in eukaryotic cells nor is it their role in cancer. Therefore, the main goal of this work was to understand the role of IRES-dependent translation in cancer development with possible implications for cancer treatment. Here, we studied the putative IRES-mediated translation of two isoforms of proteins that were shown to be upregulated in several cancers, and whose expression was shown to be promoted during cap-dependent translation inhibition: the tumor suppressor p53 isoform, Δ160p53, and a yet-to-be described GTPase H-Ras isoform, p14H-Ras. Additionally, we evaluated the effect of cancer-related mutations in the activity of each putative IRES. Therefore, we used a bicistronic construct, which contained as the 5’ cistron the coding sequence of Renilla luciferase (Rluc)⸺cap-dependently translated⸺and as the 3’ cistron the coding sequence of firefly luciferase (Fluc)⸺cap-independently translated⸺, and immediately upstream Fluc’s initiation codon the putative IRES’ sequence. The expression of each protein was assessed by quantifying their respective luciferase activity by measuring the resulting bioluminescence from each reaction with the corresponding substrate. We studied the activity of both putative IRES in the absence and in the presence of thapsigargin, an inhibitory drug of a calcium pump from the endoplasmic reticulum (ER), which leads to ER stress, and, consequently to eIF2α phosphorylation. In previous reports, Δ160p53 was shown to be expressed in an IRES-dependent way from an IRES located within the first 432 nucleotides (nt) from Δ160p53 coding sequence. Throughout this work, we performed an in silico analysis of Δ160p53’s 432-nt sequence, which indicated that this region might be, indeed, a good IRES candidate. Although not statistically significant, our bioluminescence assays’ results suggest a putative wild-type Δ160p53 IRES activity and that Δ160p53 5’UTR represses its putative IRES activity. Regarding the effect of p53’s cancer-related missense mutations (R175H, R248Q and R273H) in the putative IRES activity, our results indicate that both R248Q and R273H are capable of inducing Δ160p53 putative IRES activity in the presence of Δ160p53 5’UTR during thapsigargin-induced ER stress, whereas R175H seems to have no effect in the IRES activity. This suggests that R248Q and R273H p53 cancer-related mutations may drive tumorigenesis by promoting IRES-dependent expression of Δ160p53, which has been shown to harbor oncogenic functions. Furthermore, according to the in silico analysis, these two mutations are located within the same loop, which corresponds to the most stable one, thus suggesting that this loop may be more important for IRES activity. Additionally, we performed initial experiments to characterize the secondary structure of Δ160p53 putative IRES by chemical probing using dimethyl sulfate (DMS) as well as to detect new IRES regulated by murine double minute 2 human homolog (Hdm2), a known ITAF of X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein (XIAP) IRES that is also known to bind to Δ40p53 IRES and to regulate p53 expression, by RNA deep sequencing of Hdm2-bound RNA previously co-immunoprecipitated (co-IP) using anti-Hdm2 antibodies⸺we started by optimizing Hdm2 immunoprecipitation (IP). Regarding H-Ras putative IRES, preliminary experiments from our lab, showed that the expression of a yet-to-be described H-Ras short isoform, p14H-Ras, was upregulated during stress conditions, and that an H-Ras cancer-related silent mutation (T81>C), which is associated with higher risk for developing cancer, promoted its expression. Therefore, we hypothesized that H-Ras mRNA might contain an IRES within a 195-nt sequence, which corresponds to the putative sequence between the initiation codons of p21H-Ras and p14H-Ras. We started by performing an in silico analysis regarding the stability of possible structures located within the 195-nt sequence, which indicated that this region might be a good candidate, as well. Our results from the bioluminescence assays suggest that wild-type H-Ras putative IRES sequence is able to drive IRES-dependent expression under ER stress conditions, as well as the T81>C-mutated H-Ras putative IRES sequence. This suggests that T81>C mutation may induce the IRES-dependent expression of H-Ras, which may contribute for cancer development. In the future, we aim to perform a drug screening for drugs targeting both putative IRES and evaluate if we can possibly revert tumor progression using the most promising screened drugs. Additionally, we are expecting to characterize the IRES structure of both putative IRES studied throughout this work and to identify new IRES through RNA deep sequencing of samples obtained by Hdm2-bound RNA co-IP. We intend to identify proteins, whose IRES-mediated translation may be implicated in tumorigenesis, thus allowing the development of new cancer therapies.Loison, Luísa Romão,1963-Candeias, Marco MarquesRepositório da Universidade de LisboaNeves, Ana Rita Rodrigues2021-05-27T00:30:18Z201820182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/33871TID:201988674enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:28:49Zoai:repositorio.ul.pt:10451/33871Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:48:42.724861Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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