Aplicação de dried saliva spots na determinação de marcadores de consumo de tabaco

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Marques, Hernani Fortunato
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.6/12698
Resumo: Exposure to tobacco smoke is one of the most common causes of premature death worldwide and is the cause of 8 million deaths annually. For this purpose, it was developed, optimized, and validated a procedure for the detection of nicotine, cotinine and trans-3-hydroxycotinine (biomarkers of tobacco exposure) in oral fluid using the dried saliva spots sampling approach and gas chromatography coupled to tandem mass spectrometry, thus allowing the distinction between active and passive smokers. For optimization, 4 parameters were evaluated, namely extraction solvent, extraction solvent volume, extraction time and spots drying time. During method validation, the parameters selectivity, linearity, precision and accuracy, recovery, stability, and dilution factor were assessed. Linearity was obtained for all target analytes in the concentration range of 10-200 ng/mL allowing the quantification of compounds up to 1000 ng/mL considering the dilution factor. The method recoveries ranged from 29.2% to 43.30% for nicotine, 66.60% to 89.10% for cotinine and 80.30% to 92.80% for trans-3-hydroxycotinine, while achieving intra-day, inter-day and intermediate precision and accuracy values never greater than 10.37% and ± 6.50% respectively for all compounds. The herein described analytical method is the first that allows the determination of tobacco biomarkers in oral fluid using dried saliva spots, being considered a sensitive, simple, and low-cost alternative to conventional methods.
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During method validation, the parameters selectivity, linearity, precision and accuracy, recovery, stability, and dilution factor were assessed. Linearity was obtained for all target analytes in the concentration range of 10-200 ng/mL allowing the quantification of compounds up to 1000 ng/mL considering the dilution factor. The method recoveries ranged from 29.2% to 43.30% for nicotine, 66.60% to 89.10% for cotinine and 80.30% to 92.80% for trans-3-hydroxycotinine, while achieving intra-day, inter-day and intermediate precision and accuracy values never greater than 10.37% and ± 6.50% respectively for all compounds. The herein described analytical method is the first that allows the determination of tobacco biomarkers in oral fluid using dried saliva spots, being considered a sensitive, simple, and low-cost alternative to conventional methods.O consumo de tabaco é um dos principais problemas de saúde pública relacionado com consumo legal de substâncias. Existem mais de 1,1 mil milhões de consumidores em todo o mundo, sendo a exposição ao fumo produzido pelo consumo considerada a causa de mais de 8 milhões de mortes anuais, das quais 1 milhão se deve à exposição passiva frequente, nomeadamente ao fumo de tabaco ambiental. Este consumo pode originar doenças do foro oncológico, respiratório e cardíaco. Atualmente existem diversos formatos para o consumo, variando do mais regular cigarro até aos dispositivos eletrónicos de substituição. De forma a contornar esta problemática, têm sido implementadas diversas políticas que visam controlar o consumo em todo o mundo. O consumo de tabaco provoca a exposição do organismo a mais de 4800 compostos, sendo a nicotina um dos principais compostos e biomarcadores de interesse. Tal se deve à sua elevada percentagem na planta do tabaco e efeito aditivo ao nível do sistema nervoso central, sendo que é um agonista dos recetores colinérgicos nicotínicos. Do metabolismo de nicotina, através da ação das enzimas CYP2A6, FMO3 e UGT, resultam diversos metabolitos dos quais no presente trabalho foram selecionados dois, a cotinina e a trans3-hidroxicotinina. Estes dois metabolitos são considerados biomarcadores de maior utilidade devido aos seus tempos de meia vida (6-22 e 5-8 horas, respetivamente). Tempos de semi-vida superiores aos observados para nicotina (1,5 a-3,5 horas). A monitorização deste tipo de compostos torna-se então vital para a área clínica e toxicológica, e por esse motivo o desenvolvimento de técnicas para a sua identificação e determinação tem sido impulsionada. Para determinar estes biomarcadores, a amostra de fluido oral tem-se revelado ser uma matriz biológica de elevado interesse analítico. As aplicações de métodos de extração miniaturizados têm aumentado ao longo dos últimos anos, sendo disso exemplo os dried saliva spots (DSS), os quais têm vindo a ser aplicados como método extrativo para diferentes compostos devido ao baixo volume de amostra necessário e ao facto de possibilitar uma execução rápida e simples. Tendo como base estas premissas, o presente trabalho descreve o processo de desenvolvimento, otimização e validação de um novo método analítico para a determinação de três biomarcadores de tabaco (nicotina, cotinina e trans-3- hidroxicotinina) em fluido oral com recurso a DSS precedido de precipitação proteica, recorrendo a cromatografia gasosa acoplada a espetrometria de massa em tandem (GCMS/MS). Foram utilizados como padrões internos os análogos deuterados de cada um dos biomarcadores em estudo (nicotina-d4, cotinina-d3 e trans-3-hidroxicotinina-d3), os quais apresentam comportamento similar aos compostos em estudo. O estudo de otimização processou-se em várias etapas, sendo avaliado o tipo de solvente utilizado (9 solventes e/ou misturas), o volume de solvente (1-3mL), o tempo de extração (5-30 min) e o tempo de secagem (1h-overnight) para DSS, sendo ainda avaliados outros parâmetros complementares. A validação do método seguiu os critérios definidos pelo Scientific Working Group for Forensic Toxicology (SWGTOX), onde foram a avaliados a seletividade, linearidade, limites, precisão e exatidão, recuperações, estabilidade e fator de diluição. O método demonstrou ser linear no intervalo de concentração compreendido entre 10 e 200ng/mL, permitindo ainda a quantificação até 1000 ng/mL considerando o fator de diluição estudado. A precisão e exatidão foram avaliadas através dos coeficientes de variação e erro relativo respetivamente, não observando valores superiores a 10,37% e ±6,50% respetivamente. As recuperações obtidas alcançaram valores entre 29,2 a 43,30%para nicotina; 66,60% a 89,10% para cotinina e 80,30% a 92.,80% para trans-3- hidroxicotinina. Posteriormente o método foi aplicado a diversas amostras de fluido oral provenientes de estudantes da Universidade da Beira Interior. O método desenvolvido cumpriu todos os critérios de validação, permitindo alcançar valores de corte (cut-off) de 10 ng/mL, valor consensual entre a comunidade científica como concentração limite para a distinção entre consumidores ativos e passivos. Este método demonstrou ser um método simples e de rápida execução, permitindo realizar múltiplas extrações em simultâneo, tendo como principal vantagem a utilização de valores reduzidos de amostra de fluido oral (100 µL). Esta metodologia demonstra ser uma excelente alternativa a outros métodos de extração utilizados na área da toxicologia, contornando assim as limitações recorrentes de obtenção de volumes significativos de fluido oral. Para além disso, este método permite ainda fazer a monitorização da exposição ao fumo de tabaco, podendo ser aplicado em diversos estudos clínicos para os quais a avaliação destes biomarcadores seja pertinente. O método desenvolvido é o primeiro que utiliza fluido oral recorrendo a DSS e GC-MS/MS para a identificação de biomarcadores de consumo e exposição de tabaco.Rosado, Tiago Alexandre PiresAlba, Maria Eugénia GallardoPassarinha, Luís António PaulinouBibliorumMarques, Hernani Fortunato2023-01-18T15:26:28Z2022-02-102021-12-022022-02-10T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.6/12698TID:203174984enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-12-15T09:55:58Zoai:ubibliorum.ubi.pt:10400.6/12698Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-20T00:52:14.746829Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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