Exploring the effect of NLRP3 inflammasome inhibition in the ex vivo model of epileptogenesis

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Rosa, Nuno Miguel da Silva
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/27604
Resumo: Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017
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spelling Exploring the effect of NLRP3 inflammasome inhibition in the ex vivo model of epileptogenesisEpileptogéneseNeuroinflamaçãoInflamassoma NLRP3MCC950Teses de mestrado - 2017Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências QuímicasTese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017De acordo com a World Health Organisation, a epilepsia é uma causa crescente de morbidade e mortalidade. Atualmente, a epilepsia é a terceira condição neurológica crónica mais comum em todo o mundo, com 50 milhões de indivíduos afetados e 2,4 milhões de novos casos diagnosticados em cada ano. A epilepsia é considerada um conjunto de distúrbios cerebrais que consiste, principalmente, em convulsões recorrentes, espontâneas e sintomáticas sem identificação imediata de causa. Durante os eventos epiléticos, o indivíduo torna-se incapaz de controlar conscientemente o seu próprio corpo. Por isso, a epilepsia é uma doença com um elevado fardo emocional tanto para os pacientes como para as suas famílias. Epileptogénese é o processo pelo qual um cérebro saudável se altera e desenvolve epilepsia. Nos seres humanos, este processo é iniciado por fatores geneticamente herdados, lesões do sistema nervoso central e/ou infecções microbianas. Para induzir este processo em animais, os cientistas utilizam fatores que iniciam o status epilepticus (SE), definido como um período de convulsões contínuas com duração superior a 5 minutos. São vários os fatores utilizados nos modelos animais de epilepsia, mas os mais populares são as abordagens farmacológicas, com kainato ou pilocarpina, e protocolos específicos tais como o kindling ou a lesão cerebral. Nestes modelos ocorre um aumento da excitabilidade do sistema que desencadeia o desenvolvimento de convulsões. A morte neuronal, a ocorrência de neuroinflamação e a produção de citocinas pró-inflamatórias são consideradas marcadores moleculares da epilepsia. No entanto, os mecanismos exatos envolvidos no processo da epileptogénese não são ainda totalmente compreendidos. A ativação das células da glia, nomeadamente dos astrócitos e da microglia, denominada de gliose, ocorre na maioria das desordens neurológicas, pelo que estas células têm sido alvo de vários estudos a fim de determinar o seu papel na patofisiologia de cada doença. De facto, vários estudos têm vindo a demonstrar que tanto a microglia como os astrócitos, juntamente com os neurónios, apresentam um papel crucial na regulação da atividade epiléptica. Os astrócitos circundam os neurónios, tanto em condições fisiológicas como patológicas, e são considerados moduladores da atividade sináptica através da libertação de gliotransmissores. Em termos de morfologia celular, em locais de lesão ou infeção, estas células tornam-se activadas, o que corresponde a um aumento da proliferação celular e dos processos que emergem do corpo celular. Estas características são, frequentemente, designadas como uma cicatriz astroglial. A microglia, consideradas as células imunes por excelência do sistema nervoso central, detetam e respondem a lesões ou infeções. Normalmente, na ausência de sinais patogénicos ou de perigo, a microglia percorre o cérebro em estado de repouso, monitorizando o ambiente e supervisionando a atividade neuronal e astrocítica. Neste estado, a microglia tem uma morfologia ramificada semelhante às células dendríticas do sistema imune inato. Após ativação destas células em resposta a lesões ou estímulos pró-inflamatórios, a sua morfologia celular muda rapidamente para um estado primed, caracterizado por um maior corpo celular e por processos curtos. Finalmente, quando estas células ficam ativas, adotam um corpo celular redondo e sem processos, referido como o estado amoebóide. Neste estado e em locais de lesão, as células da microglia apresentam a capacidade (tal como as células dendríticas) de libertar vários mediadores inflamatórios, principalmente citocinas. Atualmente, várias publicações consideram a existência de uma interação entre neuroinflamação e epileptogénese, demonstrando um aumento de citocinas pró-inflamatórias, tais como a interleucina-1β (IL-1β), o factor de necrose tumoral alfa (TNF-α) e a interleucina-6 (IL-6). A IL-1β é processada pela enzima Caspase-1, que por sua vez é ativada pela formação de um complexo multiproteíco denominado inflammassoma. Vários inflamassomas já foram descritos, sendo o inflamassoma NACHT, LRR, Pirina domínios-contendo proteína 3 (NLRP3), o mais conhecido. A ativação deste inflamassoma processa-se pela deteção de patogénios e/ou sinais endógenos de perigo. Depois da ativação, inicia-se o processo de formação do inflamassoma NLRP3 através da dimerização do NLRP3 ativo e posterior ligação com a proteína adaptora de domínio de recrutamento de caspase (ASC), que por sua vez interactua com a Caspase-1. O objectivo deste estudo foi determinar se, num modelo ex vivo de epileptogénese, a inibição do inflamassoma NLRP3, utilizando um composto contendo diarilsulfonilureia, denominado MCC950, tinha efeito na neuroinflamação e na atividade epileptiforme. Este estudo utilizou um modelo de epileptogénese em fatias organotípicas de hipocampo/córtex entorrinal. Neste modelo, as fatias adquirem atividade epilética espontânea após 14 dias em cultura. Este tipo cultura apresenta várias vantagens em relação às culturas primárias, tais como o facto das células se desenvolverem de forma semelhante às células in vivo, de possuírem todos os tipos celulares (neurónios, astrócitos e microglia) e de poderem ser mantidas por longos períodos de tempo, permitindo, assim manipulação e avaliação a longo prazo. Deste modo, este modelo de epileptogénese em fatias organotípicas é um modelo simples que pode ser usado em ensaios de screening de potenciais compostos antiepiléticos. As culturas foram preparadas a partir de ratos Sprague-Dawley com 6-7 dias de vida (P6-7). De acordo com o modo de manutenção das fatias, poder-se-á obter fatias com atividade epileptiforme (EL), se mantidas em meio de cultura sem soro, ou fatias que não apresentam atividade, se na presença de meio com soro, designadas como fatias controlo (CTR). Foi então estudada a influência do composto MCC950 (10μM), neste modelo de epileptogénese, a nível de morte celular, neuroinflamação e atividade epileptiforme. Os ensaios foram realizados em amostras obtidas a 7 e/ou 14 dias in vitro (DIV). O efeito do veiculo (0.1% DMSO) foi avaliado em todos os ensaios. As diferenças na expressão de NLRP3 foram avaliadas em fatias EL e CTR a 14 DIV, visto ser neste dia que as fatias EL manifestam eventos interictais, não observados em fatias CTR. A morte celular, considerada um marcador molecular da epileptogénese, foi avaliada pela ocorrência da clivagem da αII-spectrina. Em caso de necrose, esta proteína (250 kDa) é clivada pela calpaína produzindo dois fragmentos estáveis de 150kDa (SBDP150) e de 145 kDa (SBDP145). Em caso de apoptose, a clivagem pela caspase-3 origina um produto de 120 kDa (SBDP120). A expressão da αII-spectrina e dos seus produtos de clivagem foi avaliada após incubação com o MCC950 (10μM). A neuroinflamação, outro marco importante da epilepsia, causa um aumento na expressão das proteínas “glial fibrillary acidic protein” (GFAP) e de “ionized calcium-binding molecule 1 (Iba1), marcadores de astrócitos e de microglia, respetivamente. Para além de um aumento de expressão, também ocorrem alterações na morfologia destas células, avaliadas por ensaios de imunohistoquímica, acoplados a fluorescência. As imagens foram obtidas no microscópio confocal em objetivas de 20x e 40x. O efeito do MCC950 na atividade epileptiforme foi avaliada por registos electrofisiológicos, na região CA3 do hipocampo, em fatias com 14 DIV. Os resultados demonstraram que a expressão de NLRP3 foi mais elevada em fatias EL em comparação com fatias CTR que não apresentavam atividade. A expressão da αII-spectrina e dos seus produtos de clivagem foi avaliada após incubação com o MCC950 (10μM), durante um período de 6 horas, não se tendo observado qualquer efeito. Por outro lado, a exposição ao MCC950 (10 μM) causou diminuição na expressão de Iba1 e GFAP, e nas alterações de morfologia dos astrócitos e da microglia avaliadas através de microscopia confocal. Além disso, as fatias expostas a MCC950 não demonstraram atividade epileptiforme obtida por registos de potencial de campo espontâneos a partir da região CA3 do hipocampo. Assim sendo, o MCC950 parece silenciar as descargas epiléticas recorrentes presentes nas fatias EL. Em resumo, este estudo demonstra que as fatias organotípicas com atividade epileptiforme sujeitas ao MCC950 (10 μM) exibem diminuições na astrogliose e microgliose, assim como uma actividade epileptiforme reduzida. No entanto, são necessários mais estudos para compreender melhor os mecanismos de ação do MCC950 e provar plenamente a sua eficácia como um fármaco antiepilético.Epilepsy is the third most common chronic neurological condition worldwide and is currently considered a growing cause of morbidity and mortality. It mainly consists of spontaneous and symptomatic recurring seizures with no immediate cause being identified. An association between neuroinflammation and epileptogenesis is well documented with studies now focusing on halting this disorder via potentially targeting the intracellular multi protein complex termed the inflammasome, composed by a pattern recognition receptor protein, an ASC domain and caspase-1. Various types of inflammasome have been discovered with the most well studied being the NACHT, LRR, Pyrin domains–containing protein 3 (NLRP3) inflammasome that is activated by the presence of pathogens and/or endogenous danger signals. Evidence suggests that inflammasome assembly occurs following this activation allowing for post translational processing of caspase-1, resulting in the processing of pro-IL-1β and subsequent production of IL-1β. This cytokine is released during seizures and is considered a pro-epileptogenic factor. The aim of this study was to determine if inhibiting the NLRP3 inflammasome using a diarylsulfonylurea-containing compound, named MCC950, in an ex vivo model of epileptogenesis had any effect on neuroinflammation and epileptiform activity. Results demonstrated that NLRP3 expression was higher in epileptic-like (EL) slices, compared to slices which did not depict epileptiform activity. Exposure to MCC950 (10μM) for a period of 6 hours caused lower Iba1 and GFAP expression, along with decreased alterations in astrocyte and microglia’s morphology evaluated through confocal microscopy. Furthermore, slices exposed to MCC950 did not depict epileptiform activity, assessed by spontaneous field potential recordings from the CA3 region of the hippocampus. Thus, NLRP3 targeted inhibition appears to halt epileptic recurring discharges. In summary, this study demonstrates that epileptic-like organotypic slices exposed to MCC950 (10μM) decreased astrogliosis and microgliosis, as well as a reduced epileptiform activity. However, further studies are needed to better understand its mechanisms of action and fully prove MCC950 efficacy as an anti-epileptic drug.Pinto, FranciscoCastro, Cláudia Valente deRepositório da Universidade de LisboaRosa, Nuno Miguel da Silva2017-05-05T14:57:56Z201720172017-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/27604TID:201866013enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-11-20T17:34:53Zoai:repositorio.ul.pt:10451/27604Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openairemluisa.alvim@gmail.comopendoar:71602024-11-20T17:34:53Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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