Estudo em tempo real e in vivo da regulação do metabolismo da Saccharomyces cerevisiae pelo H2O2

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Bento, Rafael Nogueira
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/20828
Resumo: Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015
id RCAP_b60d1c85eebe1e9a16b24a063c380d64
oai_identifier_str oai:repositorio.ul.pt:10451/20828
network_acronym_str RCAP
network_name_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository_id_str 7160
spelling Estudo em tempo real e in vivo da regulação do metabolismo da Saccharomyces cerevisiae pelo H2O2MicrocalorimetriaS. cerevisaeMetabolismo celularH2O2Stress oxidativoTeses de mestrado - 2015Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências QuímicasTese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015A microcalorimetria deteta o fluxo de calor associado à amostra analisada, sendo uma técnica com uma elevada sensibilidade e capaz de acompanhar o metabolismo celular em tempo real e em condições não-invasivas. Os resultados das experiências calorimétricas, regra geral, são apresentados sob a forma de curvas de fluxo de calor vs tempo (∆φ-t) ou de potência dissipada vs tempo (curvas P-t). A curva P-t associada ao crescimento de vários microrganismos, como a Saccharomyces cerevisiae, geralmente, com a glucose como fonte de carbono e energia já foi alvo de diversos estudos. É possível associar singularidades observadas na curva P-t a fenómenos biológicos específicos (ex: transição diáuxica) e analisar a resposta metabólica a vários stresses, como o efeito de antibióticos sobre vários microrganismos. Apesar de existirem evidências que sugerem que o metabolismo celular é altamente dinâmico e que a potência dissipada por célula varia ao longo do crescimento, este assunto tem sido ignorado. Aliás, é muito comum assumir que cada fase de crescimento tem uma potência dissipada por célula constante. O peróxido de hidrogénio (H2O2) é uma molécula biológica ubíqua que atua como sinalizador intracelular a doses baixas, mas induz stress oxidativo a doses altas. É conhecido que as células desenvolvem uma resposta adaptativa contra doses sub-letais de H2O2, adquirindo uma maior resistência contra o stress oxidativo moderado induzido por este oxidante. Em S. cerevisisae, esta é uma resposta metabólica global que envolve vários processos celulares e afeta, por exemplo, a permeabilidade membranar ao H2O2, o metabolismo catabólico da glucose e a proliferação celular. Neste trabalho, acompanhou-se o crescimento e metabolismo celular da S. cerevisisae com a glucose como fonte principal de carbono e energia na presença e ausência de H2O2 por calorimetria de condução de calor e medições de densidade ótica a 600 nm (OD600). A exposição celular ao H2O2 realizou-se durante a fase exponencial por (i) três adições bolus de 150 µM intervaladas de 40 min (H2O2bolus) ou, (ii) por uma dose estacionária de 150 µM durante 90 min, que resulta numa dose final de cerca de 600 µM (H2O2ss). Os objetivos deste trabalho foram: (i) perceber como é que a potência dissipada por célula varia durante o crescimento; (ii) desenvolver um novo método de administração de uma dose estacionária de H2O2 independente de enzimas; (iii) comparar as respostas metabólicas celulares a adições bolus ou a uma dose estacionária de H2O2. A análise quantitativa dos perfis das curvas P-t e OD600-t permitiu concluir que: (i) o metabolismo celular está continuamente a ajustar-se e encontra-se mais ativo durante a fase lag; (ii) fases de crescimento associadas a uma reprogramação metabólica extensa (fase lag e início da pós-diáuxica) têm um desvio energético para a divisão celular baixo; (iii) o metabolismo respiratório permite um maior direcionamento energético para a divisão celular, apesar de estar associado a uma taxa de crescimento menor; (iv) a exposição ao H2O2bolus causa um decréscimo da taxa de crescimento da fase exponencial de cerca de 4 % e reduz o calor libertado associado à fermentação da glucose por cerca de 20 % (77±3 kJ.mol-1) em relação ao controlo (96±7 kJ.mol-1), implicando grandes alterações metabólicas; (v) a exposição a H2O2ss também causa um decréscimo de cerca de 4 % da taxa de crescimento da fase exponencial, mas não afeta o calor libertado associado ao consumo da glucose (90±4 kJ.mol-1) e, de facto, aumenta a resistência celular ao stress oxidativo associado ao metabolismo respiratório da fase pós-diáuxica, resultando numa maior proliferação celular. Concluindo, a potência dissipada por célula, altamente variável, revela que o metabolismo está num estado dinâmico ao longo de toda a curva de crescimento e não num estado estático como é muitas vezes assumido. Esta observação mostra que a assunção típica de que, em certos períodos do crescimento, a potência dissipada pela população celular varia de forma linear com o número de células é incorreta. A S. cerevisiae favorece o consumo fermentativo da glucose em relação ao oxidativo porque, apesar de menos eficiente, permite uma taxa de crescimento maior. Esta observação suporta a ideia geral de que o metabolismo das células cancerosas está otimizado para a proliferação celular máxima e não para a eficiência energética máxima, uma vez que este tipo de células também favorece o metabolismo fermentativo. A resposta ao H2O2 varia dependendo do seu modo de administração, com a adição bolus a exigir um maior gasto energético que a dose estacionária. Esta observação está de acordo com a ideia de que um stress pulsado conduz a uma resposta celular menos eficiente que um contínuo. Além disso, a maior proliferação celular das culturas expostas à dose estacionária de H2O2 contradiz o compromisso entre a divisão celular e a resposta a stresses tipicamente assumido.Microcalorimetry measures the heat flow associated to the analyzed sample and has proved to be a very sensitive technique to follow cell metabolism in real time under non-invasive conditions. The results of those experiments are normally given as heat-flow rate versus time (∆φ-t) or power versus time (P-t) curves. The P-t curve associated to the growth of various microorganisms, such as S. cerevisiae, mainly with glucose as the carbon and energy source has been the subject of various studies. It is possible to detect signatures of specific biological events (e.g. diauxic shift) and of cell responses to various stresses, such as the effect of antibiotics on several microorganisms. Albeit there is evidence that cell metabolism is highly dynamic and that the dissipated power per cell changes during growth, this subject has been overlooked. Moreover, the assumption that each growth phase has a constant dissipated power per cell is very common. Hydrogen peroxide (H2O2) is a ubiquitous biological molecule that has intracellular signaling functions at low doses, but causes oxidative stress at high doses. It is known that cells develop an adaptive response against sub-lethal H2O2 doses, becoming more resistant to mild-oxidative stress induced by this oxidant. In S. cerevisiae, this is a global metabolic response that involves various cellular processes and affects, for example, membrane permeability to H2O2, glucose catabolism, and cell proliferation. In this work, cellular growth and metabolism of S. cerevisiae with glucose as the main carbon and energy source was followed in the absence and presence of H2O2 by using heat-conduction flow calorimetry and optical density measurements. H2O2 was added during the exponential phase of growth through (i) three 150 µM consecutive H2O2 bolus doses at times 0, 40 and 80 min (H2O2bolus) or, (ii) a 150 µM H2O2 steady-state, obtained by delivering approximately 600 µM H2O2 during 90 min (H2O2ss). The aims of this work were: (i) to understand how the dissipated power per cell varies during growth; (ii) to develop a new, enzyme free, steady-state H2O2 delivery method; (iii) to compare cellular metabolic responses to H2O2 delivered either as three consecutive bolus (single) additions or as a steady-state. A detailed quantitative analysis of the obtained P-t and optical density curves led to the following main observations: (i) cell metabolism is continuously adjusting itself and is most active during the lag-phase of growth; (ii) periods associated to an extensive metabolic reprogramming (lag and early diauxic phases) have a low energy deviation to cellular division; (iii) respiratory metabolism allows a higher energy deviation to cell division than fermentative metabolism, despite being associated to a lower growth rate; (iv) exposure to H2O2bolus decreases cell growth rate by near 4 % during exponential phase and decreases the released heat associated to glucose fermentation by 20 % (77±3 kJ.mol-1) when compared to control (96±7 kJ.mol-1), implying major metabolic changes; (v) exposure to H2O2ss also reduces the cell growth rate by about 4 % but does not change the heat produced by glucose fermentation (90±4 kJ.mol-1) and, in fact, improves cell resistance to the oxidative stress associated to the diauxic phase of growth leading to an increased cell proliferation. In conclusion, the dissipated power per cell is continuously changing, thus revealing that cell metabolism is highly dynamic and not a steady-state process as is commonly assumed. The common assumption that in some periods of the growth phases the power dissipated by the cell population varies linearly with the cell number is incorrect. S. cerevisiae prefers fermentative over oxidative consumption of glucose because, despite less efficient, allows a higher growth rate. This observation supports the idea that cancer cell metabolism is optimized towards maximum cell proliferation and not to maximum energetic efficiency, as fermentative metabolism is also favored in this type of cells. Response to H2O2 is strongly path-dependent, with bolus exposure triggering a higher energetic cost than steady-state exposure. This observation is in agreement with the idea that a pulsated stress leads to a less efficient response than a continuous one. It is finally interesting to note that the higher cell proliferation shown by cultures exposed to H2O2 steady-state additions contradicts the commonly assumed trade-off between cell growth and stress response.Antunes, Fernando José Nunes,1969-Piedade, Manuel Eduardo Ribeiro Minas da,1957-Repositório da Universidade de LisboaBento, Rafael Nogueira2015-12-17T16:27:49Z201520152015-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/20828TID:201384175porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:06:37Zoai:repositorio.ul.pt:10451/20828Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:38:44.729781Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
dc.title.none.fl_str_mv Estudo em tempo real e in vivo da regulação do metabolismo da Saccharomyces cerevisiae pelo H2O2
title Estudo em tempo real e in vivo da regulação do metabolismo da Saccharomyces cerevisiae pelo H2O2
spellingShingle Estudo em tempo real e in vivo da regulação do metabolismo da Saccharomyces cerevisiae pelo H2O2
Bento, Rafael Nogueira
Microcalorimetria
S. cerevisae
Metabolismo celular
H2O2
Stress oxidativo
Teses de mestrado - 2015
Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Químicas
title_short Estudo em tempo real e in vivo da regulação do metabolismo da Saccharomyces cerevisiae pelo H2O2
title_full Estudo em tempo real e in vivo da regulação do metabolismo da Saccharomyces cerevisiae pelo H2O2
title_fullStr Estudo em tempo real e in vivo da regulação do metabolismo da Saccharomyces cerevisiae pelo H2O2
title_full_unstemmed Estudo em tempo real e in vivo da regulação do metabolismo da Saccharomyces cerevisiae pelo H2O2
title_sort Estudo em tempo real e in vivo da regulação do metabolismo da Saccharomyces cerevisiae pelo H2O2
author Bento, Rafael Nogueira
author_facet Bento, Rafael Nogueira
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Antunes, Fernando José Nunes,1969-
Piedade, Manuel Eduardo Ribeiro Minas da,1957-
Repositório da Universidade de Lisboa
dc.contributor.author.fl_str_mv Bento, Rafael Nogueira
dc.subject.por.fl_str_mv Microcalorimetria
S. cerevisae
Metabolismo celular
H2O2
Stress oxidativo
Teses de mestrado - 2015
Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Químicas
topic Microcalorimetria
S. cerevisae
Metabolismo celular
H2O2
Stress oxidativo
Teses de mestrado - 2015
Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Químicas
description Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015
publishDate 2015
dc.date.none.fl_str_mv 2015-12-17T16:27:49Z
2015
2015
2015-01-01T00:00:00Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv http://hdl.handle.net/10451/20828
TID:201384175
url http://hdl.handle.net/10451/20828
identifier_str_mv TID:201384175
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron:RCAAP
instname_str Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron_str RCAAP
institution RCAAP
reponame_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
collection Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository.name.fl_str_mv Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
repository.mail.fl_str_mv
_version_ 1799134287594782720

Registros relacionados