Desenvolvimento de métodos eficientes para análise de biomarcadores preditivos em biópsias líquidas para aplicação em pacientes com carcinoma do pulmão de não pequenas células

• Autor(a) principal: Miranda, Juliana Carvalho
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10348/10465
• topic: Cancro de pulmão de não pequenas células (CPNPC); cfDNA

O cancro de pulmão de não pequenas células (CPNPC) é o tipo mais comum de cancro do pulmão, sendo responsável pela maioria casos de cancro. Este encontra-se, geralmente, num estadio avançado quando diagnosticado, diminuindo a taxa de sobrevida. A aplicação de terapias dirigidas (como afitinib, crizotinib) depende da deteção de alterações em genes específicos (como EGFR e ALK), sendo estes considerados biomarcadores preditivos. Atualmente, são utilizadas técnicas de PCR e/ou sequenciação de Sanger para determinar alterações moleculares em biópsias tumorais (que normalmente estão fixadas em formalina e embebidas em parafina – FFPE). Porém, as limitações na dificuldade de obtenção de amostra com qualidade têm levado à necessidade de encontrar alternativas viáveis para determinar a evolução da doença ou até a detetar precocemente. Uma alternativa viável são as biópsias líquidas, consideradas um método confiável e minimamente invasivo para a deteção de mutações genéticas específicas. Este trabalho tem como objetivo desenvolver um teste simples, certificado e com maior sensibilidade analítica para a deteção de mutações associadas a diferentes respostas terapêuticas em biópsias líquidas de doentes com CPNPC. Para tal, foi necessário: definir o método de acondicionamento e extração de cfDNA e desenhar e otimizar ensaios para deteção de mutações no gene EGFR. Relativamente ao acondicionamento e extração de cfDNA a partir de biópsias liquidas, o uso de esferas magnéticas para extração de cfDNA (especificamente o kit GenElute UltraMag Cell-DNA) e os tubos para colheita Cell-Free DNA Collection Tube (CE-IVD) (Roche) mostraram ser adequados e eficientes para obtenção de cfDNA até 6 dias após a de colheita de sangue. Para o desenho dos ensaios de diagnóstico foi feito um estudo das mutações do gene EGFR relacionadas com resposta terapêutica e os “primers” foram desenhados de forma a englobarem todas as alterações relevantes. Após otimização do multiplex PCR foi possível amplificar os exões 18, 19, 20 e 21 do gene EGFR a partir de amostras de cfDNA e sequenciar por NGS. Este método mostrou-se eficiente para a deteção de mutações no gene EGFR, tendo sido detetada uma deleção específica no exão 19 –p.E746_A750delELREA. Desenvolvemos também ensaios de HRM (“High Resolution Melting Temperature”) como uma alternativa de deteção mais rápida e sensível. Os resultados foram promissores, uma vez que conseguimos uma sensibilidade de 0.25% (fração de alelo mutante) para detetar alterações no exão 19 e foi possível também identificar a mutação previamente analisada por NGS (Exão 19- p.E746_A750delELREA) na mesma amostra de cfDNA. O desenho dos ensaios para deteção de alterações no gene ALK encontra-se em desenvolvimento, tendo sido feita a análise “in silico” das mutações/fusões no gene ALK relacionadas com diferentes respostas terapêuticas e o desenho dos “primers” para deteção das mutações em amostras de cfDNA de doentes com CPNPC. Com este trabalho verificamos o potencial que a utilização das biopsias líquidas tem como uma alternativa válida e confiável para a deteção de mutações no EGFR. Esta abordagem permitirá o seguimento (não invasivo) dos doentes com CPNPC durante a terapia, representando uma grande vantagem, pois frequentemente adquirem mutações específicas que provocam resistência aos tratamentos.