Effect of Temozolamide in the U-118 glioma cell line

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Carmo, Anália Georgina Vital do
Data de Publicação: 2014
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10316/37305
Resumo: Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra.
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spelling Effect of Temozolamide in the U-118 glioma cell lineGlioblastomaTemozolamideSignaling pathwaysAKT/PI3KERK1/2Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra.Glioblastomas (GBM) are the most lethal subtype of astrocytomas, with a survival rate of 12 months after diagnosis. The gold standard treatment of GBM, which comprises surgery followed by the combination of radiotherapy and chemotherapy with temozolomide (TMZ), increases the survival rate to 14.6 months. The success of TMZ seems to be limited by the occurrence of chemoresistance that allows glioma cells to escape from death signaling pathways. The mechanisms of TMZ action and of chemoresistance development are not completely understood. When TMZ started to be used the chemoresistance was associated to an increased activity of DNA repair enzymes, namely MGMT. However, recent studies pointed that the activity of survival signaling pathways such as PI3K/AKT, ERK 1/2 MAP kinase and autophagy also contributes to chemoresistence, but the interaction between those signaling pathways and TMZ has not been fully investigated. Therefore, our aim was to study the TMZ mechanism of action in the U-118 human glioma cell line and at the same time to investigate the possible mechanisms associated to the development of chemoresistance. For that, U-118 cells were incubated with TMZ and the activity of the survival pathways PI3K/AKT, ERK 1/2 MAP kinase and autophagy as well as the proliferation and apoptosis ability were studied. Cell proliferation was evaluated by incorporation of bromodeoxyuridine. Apoptosis was studied by flow cytometry and also by fluorescence confocal microscopy. The expression of LC3, PI3/AKT and ERK1/2 was evaluated by western blot. In U-118 cells, TMZ induced a significant reduction of the proliferation ability, but only a slight increase in the percentage of apoptotic cells. The evaluation of autophagy revealed that TMZ induced an increase in LC3 expression, the autophagyassociated protein, suggesting that U-118 cells may use autophagy to escape from cell death. In addition, TMZ induced a slight reduction in the phosphorylation status of PI3K/AKT, but did not alter the phosphorylation status of ERK1/2 MAP kinase which suggests that these signaling pathways may also contribute to chemoresistance. In order to confirm the contribution of autophagy, PI3K/AKT and ERK 1/2 MAP kinase to chemoresistance, U-118 cells were incubated with specific inhibitors of the pathways plus TMZ and the occurrence of apoptosis was evaluated by flow cytometry. The results showed that chemoresistance was partially overwhelmed when the cells were simultaneously treated with TMZ plus the inhibitors. Therefore, our results indicated that the treatment of GBM with alkylating agents such as TMZ should be accompanied by the use of inhibitors of the survival pathways.Os glioblastomas (GBM) são considerados os astrocitomas mais letais, apresentando uma taxa de sobrevivência de 12 meses após o diagnóstico. O tratamento dos GBM assenta na cirurgia seguida de radioterapia e quimioterapia com temozolamida (TMZ). A TMZ é considerada o padrão de ouro no tratamento destes tumores desde que foi demonstrado que a taxa de sobrevivência dos doentes tratados com TMZ aumentava em média para 14.6 meses, após o diagnóstico. No entanto, o sucesso da TMZ é limitado pela ocorrência de quimioresistência que permite que as células activem mecanismos de fuga às alterações induzidas pela TMZ. Os mecanismos celulares e moleculares que contribuem para a quimioresistência não são bem conhecidos. Nos estudos iniciais pensou-se que a resistência estava associada à actividade das enzimas reparadoras do DNA, nomeadamente à MGMT. No entanto, estudos mais recentes demonstraram que as vias de sinalização associadas à sobrevivência celular como a PI3K/AKT, cinase ERK 1/2 MAP e autofagia pareciam também contribuir para a quimioresistência. Os mecanismos de interação entre a TMZ e as vias de sinalização não foram ainda completamente estudados. Assim, o objectivo deste trabalho foi estudar o mecanismo de acção da TMZ na linha celular de glioma U-118 e ao mesmo tempo tentar identificar os mecanismos envolvidos na quimioresistência. Para tal, incubaram-se células U-118 com TMZ e avaliou-se a actividade das vias de sinalização PI3K/AKT, ERK 1/2 MAP cinase e autofagia bem como a taxa de proliferação e de apoptose. A proliferação celular foi determinada utilizando a bromodeoxiuridina. A percentagem de células apoptóticas foi avaliada por citometria de fluxo e por microscopia confocal de fluorescência de modo a determinar a percentagem de células em sub G0/G1 e o grau de condensação de cromatina, respectivamente. A expressão de LC3, PI3/AKT e de ERK1/2 foi avaliada por "western blot". Verificou-se que nas células U-118 a TMZ induziu uma redução significativa da proliferação mas que apenas induziu um ligeiro aumento na percentagem de células apoptóticas. Verificou-se também que a TMZ induziu um aumento significativo na expressão de LC3, o que parece indicar que a TMZ induz autofagia e consequentemente pode contribuir para que as células U-118 sejam resistentes ao tratamento com TMZ. Os resultados obtidos demonstraram também que a TMZ induz uma ligeira redução na fosforilação da PI3K/AKT mas que não altera o estado de fosforilação da cinase ERK1/2 MAP. A manutenção da actividade destas vias de sinalização pode também contribuir para a quimioresistência. Para confirmar que a autofagia, a PI3K/AKT e a cinase ERK 1/2 MAP podem contribuir para quimioresistência, células U-118 foram incubadas com inibidores específicos destas vias de sinalização e a percentagem de células apoptóticas foi determinada por citometria de fluxo. Os resultados demonstraram que na presença destes inibidores a percentagem de células apoptóticas aumentava quando comparada com a percentagem de células apoptóticas obtida apenas na presença de TMZ. Assim, os resultados obtidos neste trabalho parecem indicar que o tratamento de células de glioma deve ser um tratamento combinado envolvendo não só agentes alquilantes como a TMZ mas também inibidores específicos das vias de sinalização envolvidas na sobrevivência e morte celular.2014-07-17info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttp://hdl.handle.net/10316/37305http://hdl.handle.net/10316/37305TID:201626470engCarmo, Anália Georgina Vital doinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2022-03-08T10:53:52Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/37305Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T20:45:03.898463Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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