Breaking the wall! Deconstruction of the celullosome - a journey from cohesin-dockerinexpression to novel carbohydrate binding module structures

• Autor(a) principal: Pires, Ana José de Oliveira Nunes
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10437/7616
• topic: MESTRADO EM ENGENHARIA BIOTECNOLÓGICA; BIOTECNOLOGIA; CELULOSSOMAS; BIOTECHNOLOGY; CELLULOSOMES

Os Ruminantes estabelecem relações simbióticas, altamente complexas, com bactérias anaeróbias produtoras de celulossomas de forma a degradarem eficientemente os polissacarídeos da parede celular de vegetal. Os celulossomas são compostos por enzimas modulares constituídas por módulos catalíticos ligados a módulos não-catalíticos, envolvidos em ligações proteína:carbohidratos (Carbohydrate-Binding Modules ou CBMs) e interações proteína:proteína (Coesinas:Doquerinas ou Coh-Doc). Este projeto visa ampliar o conhecimento dos celulosomas e dos seus componentes, explorando tanto o complexo Coesina-Doquerina como os CBMs. Apesar de já se encontrar bem caracterizado, o processo de produção e cristalização do complexo Coesina-Doquerina de Bacteroides cellulosolvens, ainda necessita de alguma otimização. Forçando o complexo a adotar apenas uma das suas duas conformações possíveis, através de mutagénese direta, pretende-se testar e otimizar a sua purificação. Os mutantes positivos foram testados em diferentes condições de crescimento, sendo a melhor expressão obtida em células BL21 induzidas a 25ºC em meio LB. Dos vários CBMs ainda por caraterizar de Ruminococcus flavefaciens estirpe FD-1 selecionámos o Rf2 e o Rf4 para, através de géis de afinidade, determinar a sua afinidade a diversos substratos: HEC, β-Glucano, Galactomanano e xiloglucano. Concluímos que a RF2 apresenta maior afinidade para Galactomanano e xiloglucano variando entre 56 e 49 (w/v)-1, respetivamente. A Rf4 apresenta apenas afinidade para o xiloglucano com um Ka significativo de 296 (w/v)-1. Por último, a estrutura deste novo CBM-Rf2 foi resolvida por difração de raios-X por dispersão anómala de comprimento de onda único.