Isolamento e caracterização de um RNA regulador, de Cantharellus cibarius, com atividade antitumoral

• Autor(a) principal: Marques, Ana Patrícia dos Santos
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10348/8538
• topic: Cantharellus cibarius; atividade anticancerígena

Cantharellus cibarius é um cogumelo comestível de amplo consumo devido às suas propriedades sensoriais. Estudos prévios demonstraram que este cogumelo apresenta uma elevada atividade antiproliferativa contra várias linhas celulares cancerígenas, sendo o principal responsável por esta ação uma fração isolada por cromatografia de troca aniónica, que os dados disponíveis indicavam ser maioritariamente constituída por ácido ribonucleico (RNA). Os principais objetivos deste estudo foram a confirmação da natureza da molécula responsável pela atividade antitumoral, observação da sua ação, determinação da sequência de nucleótidos constituintes do RNA em causa e execução de estudos preliminares relacionados com potenciais locais da sua interação e ação na célula. Os biopolimeros do Cantharellus cibarius foram inicialmente extraídos, isolados e purificados, tendo-se obtido três frações: CC1, CC2 e CC3, sendo esta última a fração que apresentou capacidade antitumoral. De seguida, as frações foram caracterizadas quimicamente, com especial enfoque na fração CC3. Foi realizada a análise da sua composição em açúcares, ácidos gordos e fosfolípidos e realizou-se um estudo inicial da sua natureza química rica em ácidos nucleicos através de metodologias como eletroforese em gel de agarose, espectrofotometria UV-vis e FTIR. Após sugestão da presença de RNA, realizou-se a síntese de cDNA a partir do RNA isolado e a sua amplificação por DOP-PCR. De seguida procedeuse à clonagem dos produtos PCR obtidos e extração do DNA plasmídico dos clones positivos. Estes foram sequenciados e as sequências obtidas foram analisadas bioinformaticamente de modo a estudar o tipo de RNA presente. Adicionalmente, a fração CC3 foi colocada em contacto com a linha celular Caco-2 de modo a verificar a sua ação antitumoral sendo, de seguida, executada a técnica de RNA-FISH de modo a observar a sua possível incorporação no interior da célula. Com base na sequência mais conservada, e de forma ainda muito preliminar, efetuou-se a sua síntese artificial (mimics). O mimics tem como finalidade ser, posteriormente, utilizado em estudos celulares que permitam observar o fenótipo verificado diretamente a partir de CC3. A análise da composição em açúcares mostrou que o açúcar maioritário presente na fracção CC3 é a ribose, principal constituinte do RNA (também confirmado por espectrofotometria UV-vis, eletroforese e FTIR). Através da sequenciação e posterior análise bioinformática foi possível descobrir qual a sequência de RNA potencialmente responsável por esta atividade (CCTGCAGGTCGA-CTCTAGAGGATCCCCC-CGACTCGAGTCGG), sendouma sequência de pequeno tamanho e com elevada percentagem de guaninas e citosinas, formando, provavelmente, uma molécula com uma estrutura secundária estável. A fração em estudo mostrou possuir atividade antitumoral, provocando a morte celular das células Caco-2 ao fim de 48h. Através do RNA-FISH foi possível verificar que o RNA presente em CC3 se incorpora nas células atravessando tanto a membrana celular como nuclear, acumulando-se no citoplasma e no núcleo das mesmas. O C. cibarius revelou apresentar componentes com atividade anticancerígena e, uma vez descoberta a sequência de RNA alvo e demonstradas as suas interações com a célula, este trabalho torna-se bastante promissor para a futura síntese artificial deste RNA, sem recorrer ao cogumelo, uma vez que este não é cultivável, podendo, num futuro próximo, proceder-se à sua síntese artificial e posterior incorporação em fármacos.