Development of a PCR system for detection and differentiation of Bulkholderia mallei and B. pseudomallei in clinical and environmental matrices

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Brás, Catarina Barreto
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/22565
Resumo: Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015
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spelling Development of a PCR system for detection and differentiation of Bulkholderia mallei and B. pseudomallei in clinical and environmental matricesBurkholderia malleiBurkholderia pseudomalleiDuplex qPCRSpiked samplesBioterrorismoTeses de mestrado - 2015Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015Mormo e melioidose são patologias causadas pelas bactérias Gram-negativas Burkholderia mallei e B. pseudomallei, respectivamente. Sendo os equídeos o principal alvo hospedeiro de mormo, cavalos, mulas e burros para exportação necessitam de procedimentos standard europeus de despistagem do agente através de ensaios de fixação do complemento pela detecção de anticorpos específicos. Erradicado de Portugal em 1952 e da Europa Ocidental, o mormo é ainda reportado em alguns locais da Ásia, África, Médio Oriente e América do Sul. Nunca declarada em território português, a melioidose trata-se duma doença endémica em países como Tailândia e norte da Austrália, com expansão em países do continente asiático como as Filipinas, India, Indonésia, Laos, Singapura, Camboja e Vietname, alertando-se também para sua existência em zonas de África e América do Sul. O potencial zoonótico de B. mallei é descrito na literatura, estando identificados como principais grupos de risco investigadores científicos, cujo alvo de estudo implica a manipulação e multiplicação do microorganismo, profissionais de medicina veterinária e funcionários de matadouros. Afectando os animais, o homem e ambiente, a capacidade zoonótica de B.pseudomallei não se encontra estabelecida. Contudo, estão declarados inúmeros factores de risco que contribuem para a transmissão da doença no hospedeiro humano, nomeadamente: diabetes, alcoolismo, doenças crónicas renais, hepáticas e pulmonares e terapias imunossupressoras. As manifestações clínicas de ambas as patologias culminam, geralmente, em vastas complicações a nível pulmonar, podendo levar à morte. As vias de transmissão das duas doenças são principalmente cutânea, através de lesões expostas, inalação e, ocasionalmente, ingestão. Não existem vacinas ou tratamentos 100% eficientes contra ambas as doenças. Contudo, algumas terapias com base em combinações de diversos antibióticos têm sido estabelecidas mas a sua eficácia depende do progresso de cada patologia e, portanto, qualquer caso de mormo e/ou melioidose deve ser tratado com o máximo de brevidade possível. Devido à sua rápida disseminação, capacidade de infecção por inoculação e formação de aerossóis, alto factor de contágio e largo espectro de resistência antimicrobiana, B. mallei e B. pseudomallei foram classificados como agentes de classe B pelo Centre of Disease Control (CDC) e de risco 3 pelo Parlamento Europeu, segundo a Directiva 2000/54/CE. Numa reunião organizada em conjunto pela Organização Mundial da Saúde (WHO) e a Organização Mundial da Saúde Animal (OIE), especialistas alertaram para o risco eminente em países cujos mecanismos de preparação e prevenção para determinados agentes se encontram inactivos, tornando-os mais susceptíveis à libertação deliberada do agente. Tendo em conta as declarações acima descritas, protocolos foram estabelecidos para a detecção e diferenciação de B. mallei e B. pseudomallei, utilizando a metodologia biomolecular através da técnica quantitativa em tempo real de reacção de polimerização em cadeia (qPCR) em matrizes clínicas e ambientais. Deste modo, e uma vez que não existem amostras clínicas e ambientais de mormo e/ou melioidose em Portugal, três matrizes foram seleccionadas para serem inoculadas com diluições decimais seriadas de B. mallei NCTC 10245 e B. pseudomallei NCTC 10276, de modo a obterem-se amostras experimentalmente infectadas ou spiked samples. A escolha das matrizes teve em consideração as amostras comumente recolhidas quando há suspeita de alguma destas infecções: zaragatoas, pois os exsudados ou feridas purulentas são normalmente colhidos com estas ferramentas; macerados pulmonares, visto que ambas as doenças proliferam a nível pulmonar e, no caso específico de melioidose, solos, uma vez que este é o reservatório natural de B. pseudomallei. À excepção dos macerados pulmonares, a identificação de ambos microorganismos nas spiked samples foi avaliada em dois tempos diferentes: imediatamente após a infecção, e 48 horas após incubação das matrizes a 37 ºC, comparando a sensibilidade de detecção do método de cultura com a metodologia de qPCR desenvolvida. O isolamento dos agentes através de cultura bacteriana foi realizado utilizando o meio de cultura Agar Ashdown’s, específico de B. pseudomallei, e o meio de Agar Columbia com 5% de sangue carneiro para B. mallei. Enquanto B. pseudomallei produz colónias rosas rugosas morfologicamente distinguíveis, as colónias de B. mallei não detêm características particulares que permitam a sua diferenciação doutras bactérias. O duplex qPCR desenvolvido consiste num sistema capaz de identificar e diferenciar os dois microorganismos num só tubo de reacção. Dois alvos foram escolhidos para a detecção e diferenciação de B. mallei e B. pseudomallei: o gene psu que codifica para uma putativa acetiltransferase, pertencente ao cluster de genes do sistema tipo III de secreção de B. pseudomallei e um gene que codifica uma transposase ISBma2, uma sequência de inserção presente em cerca de 48 cópias e 6 cópias em B. mallei e B. pseudomallei, respectivamente. Deste modo, a amplificação e detecção de sinal por parte das sondas de hidrolisação dos dois genes alvo corresponde à identificação positiva de B. pseudomallei enquanto, a amplificação e detecção apenas do gene que codifica a transposase ISBma2 diz respeito a uma amostra positiva para B.mallei. Junto desta plataforma de diagnóstico, foi também construído um controlo interno de amplificação (IAC – Internal Amplification Control), pNZYmyx, clonando o fragmento de 125 pares de base do gene diplóide m000.5 L/R da estirpe Laussane do mixoma vírus no vector pNZY28. A finalidade deste controlo consiste em aferir se a reacção de PCR detém qualquer factor que resulte na inibição da reacção, afectando a amplificação dos genes alvo. A adaptação deste sistema de qPCR necessitou de optimização dos oligonucleotídeos necessários à reacção (iniciadores ou primers e sondas) bem como o ajuste da sua temperatura de hibridação (annealing) utilizando as estirpes de referência B. mallei NCTC 12938T e B. pseudomallei NCTC 12939T. Esta optimização de reacção foi executada com os dois alvos em separado (singleplex) e em conjunto (duplex), seguida de testes de especificidade, sensibilidade, repetibilidade e reprodutibilidade. Em singleplex, a concentração final óptima para cada alvo provou ser 400 nM enquanto que a concentração óptima das sondas de hidrolisação foram 100nM e 300 nM para ISBma2 e psu, respectivamente. As concentrações finais óptimas em duplex de primers e sonda para ambos os alvos foram, respectivamente, 400 nM e 200nM e a temperatura de annealing que demonstrou o Cq (Quantification Cycle) mais baixo foi de 58.1 ºC. A especificidade do sistema foi provada testando o qPCR com 17 microorganismos, incluindo Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeroginosa e a espécie geneticamente próxima, Burkholderia thailandensis, na qual o sinal de fluorescência foi somente detectado em B. mallei e B. pseudomallei. O sistema duplex qPCR provou ser capaz de detectar 29 fg e 455 fg de DNA de B. mallei e B. pseudomallei, respectivamente. O coeficiente de variação calculado para avaliar a repetibilidade e reprodutibilidade obteve valores máximos de 1.337% e de 2.288 %, respectivamente comprovando este sistema ser altamente repetível e reproduzível. A técnica de qPCR estabelecida foi capaz de identificar e distinguir os dois microorganismos em todas as matrizes inoculadas. No que diz respeito aos macerados pulmonares, o qPCR foi capaz de identificar correctamente os dois microorganismos até à diluição menos concentrada (10-6) detendo valores de Cq entre 15.93 (10-1) e 25.95 (10-6) em B. mallei e entre 23.44 (10-1 – alvo psu) e 38.18 (10-6 - alvo psu) para B. pseudomallei. Foi também possível identificar ambos agentes até à diluição menos concentradas para zaragatoas sem o passo de incubação, variando os valores de Cq entre 20.33 (10-1) e 39.25 (10-6) for B. mallei e entre 28.98 (10-1 - alvo psu) e 38.37 (10-6 - alvo psu) para B. pseudomallei. A adição prévia do passo de incubação para as zaragotoas demonstrou uma variação ligeira indicando com valores de Cq inferiores comparativamente às zaragatoas não incubadas. A detecção de B. pseudomallei em solos sem incubação prévia foi igualmente possível até à diluição menos concentrada. Porém, a análise de colónias isoladas provou ser altamente sensível, detectando todas as amostras com valores de Cq inferiores a 30. No entanto, o isolamento por cultura bacteriana (gold standard) provou ser um método de diagnóstico menos sensível comparando com o sistema de qPCR. A sensibilidade obtida por meio de cultura e qPCR para B. pseudomallei foi, respectivamente, 80% e 97% indicando uma baixa percentagem de falsos negativos para as duas metodologias, contudo, o método de qPCR é mais sensível mostrando ser capaz de identificar amostras consideradas negativas pelo método de cultura. Comparativamente, o método de qPCR para B.mallei mostrou ser 100% sensível ao identificar o microorganismo em todas as amostras enquanto que a sensibilidade do método de cultura para a isolação deste agente é significativamente menor, 17%, possivelmente devido à falta de um meio de cultura específico para o isolamento deste microorganismo. Desta forma, a identificação de B. mallei e B. pseudomallei por qPCR consiste num teste de diagnóstico sensível, específico, repetível e reprodutível capaz de identificar e diferenciar os dois agentes em amostras previamente inoculadas.Glanders and melioidosis are two infectious diseases caused, respectively, by the Gramnegative bacteria, Burkholderia mallei and B. pseudomallei. These species are classified as Class B agents by the Centre of Disease Control (CDC) and as level 3 risk agents by the European Parliament, due to their fast aerosol dissemination, high infectiousness, potential zoonotic capability, absence of vaccines and resistance to a wide variety of antibiotics. The potential use of these microorganisms in biological warfare, already applied in the American Civil War and World Wars I and II, leads to the need of strategic protocols in laboratories of reference to detect and differentiate both agents in a rapid, effective and distinctive way. A duplex qPCR approach was optimized and evaluated for direct detection and differentiation of Burkholderia mallei and B. pseudomallei in different matrices. Since in Portugal naturally infected tissues or contaminated material with these agents do not exist, spiked samples were previously prepared. Known concentrations of serial decimal dilutions of Burkholderia mallei NCTC 10245 and B. pseudomallei NCTC 10276 strains were inoculated in lung tissues and swabs, while soils were spiked only with B. pseudomallei NCTC 10276. The duplex qPCR has as targets the psu gene that encodes for a putative acetyltransferase specific of B. pseudomallei and the transposase of ISBma2, an insertion sequence present in about 48 copies in B. mallei genome and in about 6 copies in B. pseudomallei genome. Due to the complexity of some matrices that might present PCR inhibitors, giving PCR false negative results, an Internal Amplification Control (IAC) was constructed based on a 125 bp fragment of the m000.5L/R gene of myxoma virus, cloned in the pNZY28 vector. The duplex qPCR was firstly optimized, evaluated and compared with singlepex qPCR, using purified DNA from strains B. mallei NCTC 12938T and B. pseudomallei NCTC 12939T. Four hundred nM of each four primers proved to be the best concentration in the duplex reaction, while 200 nM were the appropriated concentration of the two probes targeting both ISBma2 and psu gene. The optimal annealing temperature, that gave detection of the target at the lowest quantification cycle (Cq) value, was 58.1 ºC. The limit of detection of the duplex qPCR was 29 fg and 455 fg for, respectively, B mallei and B. pseudomallei. The coefficient variance percentages for the repeatability and reproducibility of the duplex qPCR were, respectively, 1.337% and 2.288%, a low variance that indicates high repeatability and reproducibility. The assay was also specific for B. mallei and B. pseudomallei since it didn’t detect DNA from 13 other bacteria, including Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeroginosa and Burkolderia thailandesis. This methodology applied to the prepared spiked samples was capable to detect both agents in pulmonary macerates until the less concentrated dilution (10-6) with corresponding Cq values between 15.93 (10-1) and 25.95 (10-6) for B. mallei and between 23.44 (10-1 – psu target) and 38.18 (10-6 – psu target) for B. pseudomallei. For non–enriched swabs, both agents were also detected until the highest dilution 10-6, with Cq values ranging from 20.33 (10-1) to 39.25 (10-6) for B. mallei and from 28.98 (10-1 – psu target) to 38.37 (10-6 – psu target) for B. pseudomallei. Enriched swabs (incubation of swabs in BHIB 48h at 37ºC) but a slightly improvement in the detection of both microorganisms. The alternative approach by performing the qPCR in B. pseudomallei isolated colonies showed an increase of sensitivity of the method resulting in Cq values as low as 27.75 for the psu target. The “gold standard” culture media method performed in parallel with the qPCR detection, presented some discrepancies mainly for B. mallei swabs that showed no growth, probably due to the absence of a specific culture media for this agent proving to be less sensitive than the qPCR.Botelho, AnaMatos, Ana RitaRepositório da Universidade de LisboaBrás, Catarina Barreto2016-02-03T16:03:16Z201520152015-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/22565TID:201387476enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:09:51Zoai:repositorio.ul.pt:10451/22565Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:40:07.885842Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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