Using micropatterning of hiPSCs to induce PGC formation
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| Data de Publicação: | 2019 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/41490 |
Resumo: | Tese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019 |
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Using micropatterning of hiPSCs to induce PGC formationPGCMicropadronizaçãohiPSCGastrulaçãoin vitrohESCsTeses de mestrado - 2019Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019O estudo in vitro do desenvolvimento dos gâmetas é essencial para compreender os aspetos determinantes da fertilidade em mamíferos e em particular em humanos. Nesse âmbito inclui-se nesta tese a investigação das células precursoras deste tipo celular, as Células Germinais Primordiais (PGCs). De acordo com estudos anteriores em ratinho, as células precursoras das PGCs (pPGCs) podem ser identificadas durante o período de gastrulação. Restrições éticas e legislativas relativas à utilização de embriões humanos em fase de gastrulação se insere impedem o estudo destas últimas com recurso a cultura de embriões humanos. Como estas restrições excluem a possibilidade de efetuar análises no período em que se estima abranger a gastrulação humana, não é possível atualmente estudar estes acontecimentos com base em observações feitas com embriões humanos. Por este motivo recorreu-se a um método de cultura celular usando diferenciação de células humanas pluripotentes induzidas (hiPSCs) e células estaminais embrionárias humanas (hESCs). Este método permite replicar até um certo ponto a gastrulação in vivo. O método 2D de cultura de células desenvolvido por Warmflash et al. (2014) foi escolhido como base. Este método apoia-se na micropadronização de lamelas (com fibronectina) para obter diferenciação celular, com estimulação da via da proteína morfogenética do osso (bone morphogenetic protein4, BMP4). Tentou-se reproduzir o aparecimento dos folhetos germinativos e a sua organização em domínios distintos mutuamente repressivos, devido a moléculas secretadas por cada folheto germinativo que asseguram que células características de um não se formem nos restantes folhetos. O método de Warmflash et al. (2014) recapitula, deste modo, a gastrulação in vitro. No entanto, tal organização foi impossível de obter devido a cobertura sub-ótima dos micropadrões. Este grau de cobertura terá resultado de incompatibilidades entre células e a proteína constituinte dos micropadrões, a fibronectina (FN1). Por este motivo, um outro método baseado na cultura de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em lamelas revestidas com matrigel foi usado, também almejando a geração de PGCs in vitro. Este método produziu resultados positivos, visto que células positivas para três marcadores-chave de PGCs foram detetadas. Estas células foram detetadas ao aplicar imunofluorescência (usando um painel de anticorpos) refinado por meio de análise bioinformática, a partir de marcadores extraídos da literatura. Estes marcadores permitiram evidenciar, por meio de imagiologia às lamelas, a presença de potenciais PGCs. Com este método foi possível induzir potenciais PGCs, abrindo-se um novo meio para investigar os mecanismos e vias de sinalização para estudar estas células sem ter de recorrer ao uso de animais ou embriões humanos em cultura.Understanding PGC development is key to uncover new strategies to assist the reproduction of humans and non-human organisms. However, the study of human early gametogenesis falls under the same restrictions associated with studying human early development. This means culturing human embryos past two weeks (14 days), the estimated stage at which gastrulation should begin is out of reach under the law. This motivated the current efforts for investigating methods that replicate gastrulation in vitro as closely as possible. A 2D protocol developed initially by Warmflash et al. (2014) potentially fulfils this necessity according to tests performed by the authors. This allows the use of micropatterning for differentiating colonies of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with supplementation of bone morphogenetic protein4(BMP4). The authors showed that colonies develop the three germ layers (ectoderm, mesoderm, endoderm and extraembryonic ectoderm). The promise that this 2D platform provides the means to recreate the cellular interactions of gastrulation prompted for the question driving this study: Can primordial germ cells (PGCs) be induced from hiPSCs by differentiating them in micropatterns? To answer this question, a search for genes, that could be used as markers, was first conducted. Thus, several genes were selected from established marker genes and others whose validation has been less extensive in the literature. This was followed by a bioinformatics analysis was performed on a data set containing both germ and somatic cells from Li et al. Cell (2017). This data set was analysed in parallel with one other containing primed and naïve stem cells from Messmer et al. Cell (2019). In this manner, the exploration of these datasets resulted in a basic analysis, which was the source of proposed antibody combinations to detect PGCs. After obtaining the appropriate marker combinations for immunostaining, the 2D method was tested for its suitability to induce PGCs. However, the seeding of these micropatterns with hiPSCs or human embryonic stem cells (hESCs) revealed to be technically challenging for this study. Continuous experimental difficulties with achieving uniform attachment (coverage) of hiPSCs to the micropatterns motivated searching for PGCs in vitro through a different method, while also relying on the previously identified marker combinations. The new method used seeding of hESCs on Matrigel coated glass coverslips in conjunction with BMP4 stimulation, as applied on the micropatterns. This protocol was then used to look for indications of possible human PGCs in culture through immunostaining of the fixed coverslips, for selected marker combinations. After imaging it was possible to observe cells with PGC morphology and co-expression of key PGC markers. Due to the resemblance of the observed cells to PGCs, it is likely that PGCs may have been generated using the proposed method of stimulation. The same that is used in micropatterns by Warmflash et al. (2014). Taken together, this thesis describes a potential method to study PGC specification without animal experimentation or resorting to human embryo culture.Lopes, Susana M. Chuva de SousaRodrigues, Maria Gabriela,1965-Repositório da Universidade de LisboaBretes, Francisco Vieira2020-01-30T17:36:01Z201920192019-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/41490TID:202384608enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:40:57Zoai:repositorio.ul.pt:10451/41490Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:54:44.252549Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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