Assessment of the role of CCBE1 during cardiac fibroblast differentiation using hiPS cells

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Barreira, Daniela Sofia Ferreira
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/43675
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019
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spelling Assessment of the role of CCBE1 during cardiac fibroblast differentiation using hiPS cellsAngiogenesisCardiac regenerationhiPSCsCardiac fibroblastsCCBE1Teses de mestrado - 2019Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019Diseases of the heart and circulatory system (CVD) are the leading cause of disability and mortality in developing countries, causing 3.9 million deaths year and accounting for 45% of all deaths in Europe, with expectations to increase further. Of all cardiac pathologies, coronary artery disease (CAD) has the highest mortality rates worldwide and is characterized by the accumulation of atherosclerotic plaques in the blood vessels of the heart leading to diminished blood flow. People who survive from CAD are permanently scarred, since the disease normally progresses to myocardial infarction, leading to a drastic decline in heart function, culminating in heart failure or even sudden death. Restoring function in an infarcted heart remains a challenge, mostly because cardiomyocytes (CM) have limited proliferative capacity and the supply of nutrients and oxygen to the cardiac cells is inefficient to allow the regeneration of the tissue. The only treatment available is heart transplantation, which, however, is not a sustainable solution due to organ supply paucity and immune rejection problems. Therefore, there is an urgency in identifying molecules and signalling pathways regulating coronary vessels morphogenesis, in order to translate them into regenerative solutions. Our group identified a collagen and calcium-binding EGF domain-1 (Ccbe1) protein associated with the formation of the ventricular coronary vessels. Our current hypothesis is that the secretion of CCBE1 by the cardiac fibroblasts (CFs) will promote the development of new vascular networks from endocardial progenitors. Therefore, one of the goals of this thesis is to generate CFs from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), to posteriorly assess CCBE1 potential and role in the induction of angiogenesis in co-culture with endothelial cells. For that, we used a hiPS cell line previous established in our laboratory, and a protocol based on the modulation of the WNT pathway by small molecules. Using this protocol, we were able to obtain high quality progenitor cells, characterized by the expression of ISLET1 and NKX2.5, as well as a proepicardial population marked by high expression levels of WT1, TBX18 and TCF21, which is expressed in cardiac fibroblast lineage-specific progenitors. We also observed the expression of transcription factors associated with cardiac fibroblasts, TCF21 and HAND2, as well as the staining of Vimentin, a protein specific of cardiac fibroblast. In addition, since CCBE1 is thought to be involved in the ventricular coronary vessels formation and CFs possibly also take part in this process, we also evaluate the requirement VI of CCBE1 for the commitment of hiPSCs into CFs and understand if the modulation of this protein during the differentiation into CFs had any impact in the yield and/or morphology of these cells. We verified that the knockdown of CCBE1 during the initial 6 days of differentiation negatively affects the expression of cardiac progenitor genes, as already had been observed in mouse cells, and more importantly, enhances the expression of proepicardial genes in the end of the proepicardial phase, indicating a crucial role for CCBE1 in regulating the fate choices between cardiomyocytes and cardiac fibroblasts.As doenças cardiovasculares constituem a principal causa de morte e morbilidade nos países desenvolvidos, causando 3.9 milhões de mortes por ano. De todas as patologias cardíacas, a aterosclerose tem a percentagem mais elevada de mortalidade globalmente, sendo caracterizada pela acumulação de ateromas nos vasos coronários levando à diminuição do fluxo sanguíneo. Os ateromas são constituídos maioritariamente por lipoproteínas que se infiltram nas paredes dos vasos, levando à proliferação das células cardíacas em redor, e culminando na disfunção das células endoteliais nessa área. Esta acumulação é um processo progressivo envolvendo vários interveniente e mecanismos, e em caso de rutura da placa forma-se um coagulo que causa a oclusão do vaso, resultando num enfarte do miocárdio (EM). Quando ocorre um EM existe uma privação de oxigénio e nutriente para o restante tecido cardíaco, levando à perda de cardiomiócitos. Para compensar a perda de tecido, o ambiente pro-inflamatório do coração estimula a ativação dos fibroblastos cardíacos em miofibroblastos, os quais excretam níveis levados de proteínas da matriz extracelular (ECM) levando à formação de tecido fibrótico (cicatriz). Inicialmente, a cicatriz desempenha um papel essencial mantendo a integridade estrutural do coração, prevenindo o colapso da parede ventricular. Contudo, como o tecido fibrótico não tem a mesma estrutura ou função que o músculo cardíaco, é incapaz de contrair ritmicamente ou de propagar corretamente os sinais elétricos pelo coração, levando ao aumento da rigidez da parede ventricular, agravando a condição cardíaca podendo mesmo causar falência cardíaca. Atualmente, o único tratamento para falência cardíaca consiste em transplantes cardíacos, um tratamento difícil devido à falta de dadores e possíveis complicações imunitárias, sem referir que nem todos os pacientes são elegíeis. Tendo em conta a falta de tratamentos disponíveis para esta patologia, novas terapias regenerativas com base em células estaminais têm vindo a ganhar destaque. De facto, o estatuto pluripotente destas células torna-as capazes de se diferenciarem em vários tipos de células, consoante a estimulação fornecida. Assim, em caso de lesão, estas células podem originar células funcionais substituindo não só os cardiomiócitos lesados bem como os vasos coronários. É importante notar que para além de ser necessário repopular a área danificada com cardiomiócitos, também é indispensável promover a angiogénese para permitir o fornecimento de oxigénio e nutriente às células, aumentando a probabilidade e rapidez da regeneração celular. Em suma, promover o processo de angiogénese no tecido cardíaco danificado tornou-se num dos focos da terapia cardíaca, VIII sendo fundamental descobrir os mecanismos e células intervenientes, bem como a sua contribuição, na angiogénese cardíaca. Foi neste contexto que os fibroblastos cardíacos começaram a ganhar destaque. Inicialmente, os fibroblastos cardíacos só eram associados a condições patológicas, mas nos últimos anos tem sido demonstrado o seu contributo para a manutenção da homeostase cardíaca, com especial interesse para o seu potencial na angiogénese. Deste modo, o principal objetivo desta dissertação foi a obtenção de fibroblastos cardíacos in vitro a partir de células estaminais, para poster análise do seu potencial e funcionamento durante a angiogénese em conjunto com células endoteliais. Para tal, através da modulação da via WNT através pequenas moléculas, utilizou-se um protocolo de diferenciação em fibroblastos cardíacos numa linha celular de hiPSCs já estabelecida no laboratório. Para avaliar a eficiência do protocolo de diferenciação vários ensaios foram utilizados, tais como ensaios de qPCR, para criar um padrão de expressão genética das células nas diferentes fases, recorrendo a múltiplos marcadores genéticos específicos para cada fase da diferenciação, e também ensaios de imunocitoquímica, para comprovar o fenótipo das células diferenciados e os dados previamente obtidos por qPCR Com base neste protocolo, os resultados de qPCR indicaram uma elevada expressão de NKX2.5 e ISLET1, sugerindo a obtenção de uma população de progenitor cardíacos. Juntamente, experiências em citometria de fluxo demonstraram ao sexto dia de diferenciação, valores elevados de células marcadas positivamente para NKX2.5, confirmando a eficiência de diferenciação na primeira fase do protocolo. Relativamente, à segunda fase do protocolo de diferenciação, durante a indução de células do proepicardio, também se verificaram, através de qPCR, níveis elevados da expressão dos seus marcadores típicos WT1 e TBX18, bem como para TCF21 um marcador da transição epitelial-mesenquimatosa que é expresso em progenitores de fibroblastos cardíacos. Paralelamente, a expressão de WT1 também foi avaliada por imunocitoquímica, onde os resultados demonstraram a existência de uma população homogénea para a expressão deste marcador. Por último, a obtenção de fibroblastos cardíacos foi confirmada por qPCR, onde os marcadores TCF21 e HAND apresentaram valores razoáveis, mas também por ensaios de imunocitoquímica, onde se verificou a presença de VIMENTINA. Para além da obtenção fibroblastos cardíacos derivados de células pluripotentes, tivemos como objetivo avaliar o resultado da modulação do gene collagen and calcium-binding EGF domain-1 (CCBE1) durante o processo de diferenciação, nomeadamente perceber IX se a inibição deste gene poderia ter algum impacto na obtenção de fibroblastos cardíacos ou na morfologia dos mesmos. O gene CCBE1 codifica para uma proteína da matriz extracelular envolvida na via de sinalização do factor de crescimento do endotélio vascular C (VEFG-C), um fator angiogénico produzido na forma inativa e processado proteoliticamente para a sua forma ativa através do complexo proteico constituído pelas proteínas CCBE1 e A-disintegrin e metalloproteinase with trombospondin motifs 3 (ADAMTS3). Ou seja, CCBE1 é uma proteína essencial à síntese de VEGF-C. A maioria dos estudos realizados sobre o gene CCBE1 são focados na síndrome Hennekam, em que as mutações no gene CCBE1 levam a malformações do sistema linfático. Todavia, o gene CCBE1 também tem vindo a ser estudado como um regulador chave da formação da vasculatura ventricular, a qual é dependente da sinalização por VEFG-C. De facto, alterações nesta via condicionam a formação de vasos coronários derivados do sinusvenoso. Assim, é possível que a proteína CCBE1, para além de contribuir para a formação dos vasos do sistema linfático, também regule o processo de angiogénese cardíaca. Para já, foi demonstrado o envolvimento da proteína CCBE1 durante a fase inicial do desenvolvimento cardíaco, influenciando a migração e a proliferação dos progenitores cardíacos. Por outro lado, o fenótipo causado pela disrupção do CCBE1 na fase inicial da cardiogénese é observável em pacientes com a síndrome de Hennekam. Assim, tendo em conta o papel dos fibroblastos cardíacos (FCs) na angiogénese e a suspeita de que o gene CCBE1 possa, também, estar envolvido neste processo, torna-se necessário investigar uma possível ligação molecular entre ambos. Em particular, perceber de que forma a modulação de CCBE1 poderá afetar a formação de fibroblastos cardíacos. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que o gene CCBE1 não é altamente expresso em FCs. Contudo, estes resultados não invalidam o facto de estas células poderem expressar apenas este gene após contacto com o VEFG-C. É possível que, quando estimuladas com VEFG-C imaturo, uma cascata de sinalizações celulares seja ativada nos FCs levando à produção de CCBE1. Esta, por sua vez, poderá processar o VEFG-C e disponibilizá-lo para a angiogénese cardíaca. Todavia, estudos futuros serão necessários para confirmar esta hipótese. Não obstante, como a expressão do gene CCBE1 é elevada durante a primeira fase de diferenciação, utilizando a mesma linha celular com a qual foi estabelecida o protocolo de diferenciação, inibiu-se o gene CCBE1 através da adição de doxiciclina (DOX) às células. Após várias otimizações, conseguiu-se obter, ao sexto dia de diferenciação, uma X eficiência de inibição de 44% em células expostas à DOX, tendo os resultados confirmado que a inibição de CCBE1 influencia a expressão de genes associados ao estado de progenitores cardíacos, tal como já demonstrado em células de ratinho. Contudo, resultados inesperados foram obtidos quando se caracterizaram as células de proepicardio tratadas com a DOX, as quais apresentavam, ao décimo segundo dia de diferenciação, níveis de expressão dos marcadores de proepicardio mais elevados, comparativamente às células controlo (sem DOX). Em suma, neste trabalho foi possível não só estabelecer um protocolo de diferenciação em fibroblastos cardíacos, a partir de células pluripotentes, como também confirmar a importância do gene CCBE1 em células humanas durante a fase de diferenciação em progenitores cardíacos. Além do mais, foi possível observar uma possível dualidade na modulação do gene CCBE1 durante a fase inicial de diferenciação. Por um lado, a inibição de CCBE1 parece condicionar a expressão dos genes típicos de progenitores cardíacos, por outro, parece promover a expressão de genes de proepicardio durante a fase de diferenciação em proepicardio, um resultado interessante que merece ser mais aprofundado.Chronic Diseases Research Center (CEDOC), NOVA Medical School, University NOVA of LisbonBelo, José António Henriques de CondeCruz, Susana Zeferino Solá daRepositório da Universidade de LisboaBarreira, Daniela Sofia Ferreira2020-12-20T01:30:16Z2019-12-202019-11-222019-12-20T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/43675TID:202435369enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:44:15Zoai:repositorio.ul.pt:10451/43675Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:56:25.451320Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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