Fatty acids and lipid signaling in grapevine resistance to Plasmopara viticola

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Laureano, Gonçalo Miguel Mendes Pais Costa
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/32692
Resumo: Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018
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spelling Fatty acids and lipid signaling in grapevine resistance to Plasmopara viticolaVitis viniferaPlasmopara viticolaFosfolipase ASinalização lipídicaÁcido jasmónicoTeses de mestrado - 2018Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018A videira (Vitis vinifera L.) é a uma das plantas mais cultivadas em todo o mundo, com mais de 7.5 milhões de hectares de produção, a nível mundial. Foram identificadas mais de 70 espécies de Vitis, mas apenas a Vitis vinifera é utilizada para a produção de vinho, que por si só tem um mercado tão vasto que em 2016 gerou mais de 29 mil milhões de euros. Portugal é um dos maiores produtores e exportadores de vinho do mundo, posicionando-se em décimo primeiro lugar no ranking mundial dos países produtores de vinho. A cultura vinícola portuguesa é riquíssima, contando com mais de 250 variedades nacionais, o que torna a nossa indústria vinícola uma das mais conceituadas e apreciadas no mundo. Contudo a grande maioria das cultivares de Vitis vinifera utilizadas na indústria vinícola apresenta uma elevada suscetibilidade à doença míldio. O míldio da videira é causado pelo Plasmopara viticola (Berk. et Curt.) Berl. et de Toni, um oomycete obrigatório, que foi introduzido na Europa no final do século XIX, através de enxertos de videiras provenientes da América, que eram utilizados para replantar as videiras afetadas por uma praga causada por filoxera. O míldio da videira é uma das epidemias mais severas em culturas de videira, podendo numa única época devastar culturas inteiras, reduzindo a qualidade das uvas e afetando também a do vinho produzido, o que consequentemente leva a enormes perdas económicas. O modo de infeção do P. viticola, requer um conjunto de condições favoráveis, como temperatura moderada (21-25ºC) e humidade elevada (>75%). Quando estas condições estão reunidas, os oósporos germinam, originado zoosporângios que libertam zoósporos que migram até ao estoma onde germinam e atravessam a cavidade estomática, de forma a desenvolver as hifas primárias e o micélio. No espaço intercelular do mesófilo ocorre a diferenciação das hifas primárias no haustório, que é uma estrutura especializada que permite que o oomycete obtenha nutrientes, suprima os mecanismos de defesa e redirecione o metabolismo do hospedeiro a seu favor. Em videiras suscetíveis, formam-se as manchas de óleo características e o desenvolvimento dos esporangióforos que após emergir através do estoma, libertam os esporângios, sendo estes dispersos até tecidos hospedeiros, como folhas, frutos ou ramos, podendo originar infeções secundárias. De forma a controlar esta doença, os viticultores recorrem ao uso preventivo de fitoquímicos durante toda a época de cultivo, o que acarreta elevados custos económicos e ambientais. Uma abordagem alternativa, visando a sustentabilidade da viticultura passa pela criação de videiras hibridas resultantes do cruzamento de Vitis americanas ou asiáticas, que possuem resistência ou tolerância ao P. viticola, com variedades de Vitis com boa qualidade para a indústria vinícola. Contudo, o processo de seleção de uma videira hibrida é bastante trabalhoso e demorado, sendo necessários 2 a 3 anos até que seja possível identificar plantas que contenham as características desejadas. O objetivo principal deste trabalho é a compreensão de como se processam os mecanismos de defesa bem como quais as alterações que as videiras resistentes apresentam no combate ao míldio. Nos últimos anos, vários estudos têm sido efetuados na área das ómicas (transcritómica, proteómica e metabolómica). Estas análises permitiram identificar diferenças entre genótipos de videira resistentes/tolerantes e suscetíveis ao P. viticola, nomeadamente associadas aos mecanismos de perceção do patogénio, cascatas de sinalização e sinalização por lípidos. Na sinalização por lípidos, foi demonstrada a participação do ácido jasmónico (JA) na resposta de defesa a este patogénio biotrófico e o envolvimento de lípidos membranares. Os lípidos membranares não só têm uma função estrutural, como também estão envolvidos nos mecanismos de defesa das plantas. Em situações de stress e sob ação de fosfolipases, os lípidos de membrana fornecem substratos para a formação de moléculas de sinalização tais como os ácidos gordos (FA) livres, ácido fosfatídico, inositol trifosfato (IP3), oxilipinas entre outros. A fosfolipase A (PLA) é um importante enzima que tem a sua atividade aumentada em situações de resposta a agentes patogénicos, levando à hidrólise de fosfolípidos presentes nas membranas. Destas reações de hidrólise são libertadas diversas moléculas, que desempenham funções de sinalização ou servem de substratos para a biossíntese de moléculas de sinalização, como o JA. No âmbito deste trabalho foram englobadas três vertentes, análise da modulação dos ácidos gordos e lípidos, bioinformática e transcritómica. O perfil de ácidos gordos e lípidos de dois genótipos de Vitis vinifera com diferente tolerância ao P. viticola foi caracterizado por cromatografia em camada fina (TLC) e cromatografia gasosa (GC). As cultivares de Vitis vinifera, Regent (resistente) e Trincadeira (suscetível) são constitutivamente diferentes, no que diz respeito à composição lipídica e de conteúdo em FA. Após inoculação com P. viticola, a cultivar resistente apresenta uma modelação do conteúdo em ácidos gordos não observável na cultivar suscetível, nomeadamente uma acumulação de ácido α-linolénico (C18:3) bem como um aumento do rácio de ácidos gordos insaturados e saturados, refletindo-se numa maior fluidez das membranas celulares. As maiores alterações do conteúdo em ácidos gordos ocorreram às 6h após inoculação, pelo que selecionámos este momento para uma avaliação mais detalhada da modulação das diferentes classes lipídicas. Em Regent foi observada uma diminuição dos lípidos de membrana, fosfatidilcolina (PC) e fosfatidiletanolamina (PE), dos ácidos gordos livres bem como nos lípidos de reserva, triacilglicerol (TAG). Por outro lado, os lípidos cloroplastidiais, mono e di-galactosil diacilglicerol (MGDG, DGDG) e fosfatidilglicerol (PG), aumentam com a inoculação,nomeadamente no seu conteúdo em C18:3. As fosfolipases A hidrolisam lípidos membranares e já foram associadas à biossíntese de JA. Com o objetivo de uma melhor compreensão das vias metabólicas, associadas às alterações lipídicas observadas no genótipo resistente, sobretudo associado ao JA, focámos o nosso estudo nesta família. Conduzimos uma análise bioinformática para identificar e caracterizar os membros desta família em V. vinifera. Identificámos 41 genes, localizados em 9 dos 19 cromossomas da videira, que codificam proteínas que se distribuem em três grandes classes, fosfolipase A1 (PLA1), fosfolipase A2 secretora (sPLA2) e fosfolipase A de tipo patatina (pPLA), de acordo com a homologia de sequência. Alguns genes foram selecionados para uma análise de expressão por PCR em tempo real (qPCR) em Vitis vinifera cv. Regent inoculada com P. viticola. Os resultados obtidos demostraram que a maioria dos genes selecionados apresenta aumento de expressão, sobretudo nas primeiras horas de infeção. Um dos ácidos gordos libertados por estas enzimas é o C18:3, que é o precursor biossintético do JA, facto corroborado por uma acumulação significativa de JA, bem como a sua forma ativa JA-isoleucina (JA-Ile), às 12 horas após a infeção com o P. viticola previamente descrita para genótipo resistente, Regent. Os nossos resultados demonstraram também que o perfil de ácidos gordos permite discriminar ambos os genótipos, Regent e Trincadeira, antes da infeção com o P. viticola. De forma a avaliar se as diferenças constitutivas observadas poderão servir como biomarcadores de resistência a este patogénio, analisou-se o conteúdo em FA de várias espécies resistentes/tolerantes de videira (V. Riparia, V. Labrusca, V. Rupestris, V. Rotundifolia, V. Candicans, V. Sylvesteris e V. vinifera cv. Regent) e cultivares suscetíveis de Vitis vinifera (V. vinifera cv. Pinot noir, Trincadeira e Cabernet Sauvignon). Os nossos resultados apontam para a existência de um padrão discriminatório entre as videiras resistentes/tolerantes e suscetíveis, ao P. viticola, sobretudo ao nível dos FA insaturados, nos quais se observa uma menor quantidade de ácido oleico e linoleico (C18:1 e C18:2) e uma maior quantidade em C18:3 nas espécies de videira resistentes/tolerantes.Grapevine (Vitis vinifera L.) is one of the most cultivated crops in the world, with over 7.5 million production hectares. Among the known 70 Vitis species, Vitis vinifera is the only used for wine production, generating revenues over 29 billion euro in 2016. However, this Vitis species is highly susceptible to several fungal diseases, namely to downy mildew. Downy mildew is caused by the biotrophic obligatory oomycete, Plasmopara viticola (Berk. et Curt.) Berl. et de Toni. It was introduced in Europe in the late 19th century and soon became one of the most economically significant grapevine diseases worldwide. Current strategies to cope with this disease rely on the preventive use of phytochemical compounds on each cultivation season, representing high environmental, economical and health costs. Thus, characterization of innate resistance of some Vitis species and V. vinifera genotypes to P. viticola is crucial for the definition of sustainable disease control measures. Previous studies have shown that membrane lipids present not only a structural function but also play an important role in plant defense, providing substrates for signaling molecules, such as free fatty acids (free FA), phosphatidic acid (PA), inositol 3 phosphate (IP3), oxylipins and others. The release of fatty acids (FA) from membrane lipids is carried out by phospholipases that are activated upon pathogen perception. Among phospholipases, the role of phospholipase A (PLA) is highlighted by its participation in plant immunity, mainly through its role in jasmonic acid (JA) biosynthesis. In the present work we have characterize the FA and lipid modulation in two Vitis vinifera genotypes resistant and susceptible to P. viticola. Our results provide new insights on the modification of lipid FA profile in the first hours after pathogen challenge. Major FA modulation seems to occur in the resistant grapevine genotype Regent, α-linolenic acid (C18:3) content increases in all of the studied time-points as well as the ratio between unsaturated and saturated FA and membrane fluidity. Being 6 hours post-inoculation (hpi) the time-point were major FA alterations occur, we have further evaluated changes in lipid classes by thin layer chromatography (TLC). In the resistant genotype the content of both phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE) decreases 6h after pathogen challenge and at the same time Mono and Di – galactosyldiacylglycerols (MGDG and DGDG) and phosphatidylglycerol (PG) content increased, particularly in the C18:3 content. Moreover, we have characterized grapevine PLA superfamily, identifying 41 PLA genes. Three major classes were defined according to PLA sequence homology: phospholipase A1 (PLA1), secretory phospholipase A2 (sPLA2) and patatin-like phospholipase A (pPLA). A set of grapevine PLA genes was selected for gene expression analysis, in way to elucidate their role in grapevine resistance against P. viticola. Our results have shown that an increase of expression occurs in the majority of the selected genes, mainly at 6 hpi. Altogether our results, combined with the results previously obtained on reactive oxygen species (ROS) production and lipid peroxidation, may suggest that the decrease of PC and PE lipids content may be related to ROS signalling and PLA genes activation by Ca2+. Membrane lipid hydrolysis by PLA may, at later infection time-points, contribute to the decrease of C18:3 from galactolipids and increase of free- C18:3 enriched FA thus promoting JA biosynthesis. From our previous work, we have shown that JA and JA-isoleucine (JA-ILE) content is significantly altered in Regent at 12 hpi, thus further work has to be developed in order to fully characterize the lipid-associated signalling pathways leading to JA-signalling and plant resistance. As our results allowed also to discriminate the resistant and susceptible grapevine genotypes prior to pathogen challenge, we have also made a preliminary access of FA profile in several grapevine species and cultivars with different degrees of resistance to this pathogen. The resistant genotypes presents a distinctive lipid and FA pattern, suggesting that these molecules may represent strong candidates for the establishment of resistance associated biomarkers.Matos, Ana Rita Barreiro Alves de,1975-Figueiredo, Andreia Cristina Silva Viegas Mata,1980-Repositório da Universidade de LisboaLaureano, Gonçalo Miguel Mendes Pais Costa2019-03-01T01:30:17Z201820182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/32692TID:201911345enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:27:07Zoai:repositorio.ul.pt:10451/32692Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:47:55.493909Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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