Interaction of apoptotic and cytoprotective bile acids with biomembranes and apoptotic protein BAX

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Sousa, Tânia Patrícia Marques de
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/9429
Resumo: Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013
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spelling Interaction of apoptotic and cytoprotective bile acids with biomembranes and apoptotic protein BAXEspectroscopia/microscopia de fluorescênciaApoptoseMembranas mitocondriaisFluidez membranarProteínas apoptóticasTeses de mestrado - 2013Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013Ácidos biliares (ABs) são derivados do colesterol, sintetizados no fígado, que têm um papel central na digestão, absorção e transporte de lípidos, nutrientes e vitaminas. Este grupo é composto por moléculas que são semelhantes ao nível da sua estrutura química, mas apresentam propriedades físicas e biológicas diversas. Os ABs podem ser divididos em duas subclasses, citoprotectores e citotóxicos, de acordo com a hidrofobicidade de cada molécula. A hidrofobicidade destas moléculas está associada ao número, posição e orientação dos grupos hidroxilo e grupo terminal. Os ABs hidrofóbicos como o ácido deoxicólico (DCA) são indutores de morte celular, por activação de ambas as vias de apoptose, nomeadamente a via extrínseca que está associada à activação de receptores de morte celular e a via intrínseca ou mitocondrial que envolve a libertação de factores apoptogénicos a partir do mitocôndrio. Por outro lado, os ácidos biliares mais hidrofílicos, como o ácido ursodeoxicólico (UDCA) e tauroursodeoxicólico (TUDCA) têm a capacidade de inibir os processos apoptóticos, actuando assim como agentes citoprotectores. Em maior detalhe, tornou-se já evidente que estes ABs, em concentrações submicelares, têm a capacidade de exercer efeitos directos de cariz protector a nível celular e molecular, através da estabilização de hepatócitos e da inibição de apoptose induzida por vários agentes, como por exemplo os ABs hidrofóbicos. Contudo, o mecanismo concreto, através do qual os ABs produzem efeitos antagónicos ainda não está elucidado. Neste trabalho foi inicialmente testada a hipótese de as membranas celulares constituírem o alvo principal da acção modulatória dos ABs sobre a apoptose, tendo em conta que os ABs associam-se de forma eficiente a membranas lipídicas e eliminam parcialmente a capacidade do colesterol de aumentar a ordem da membrana lipídica. Recorreu-se ao uso dos ABs DCA, UDCA e TUDCA, bem como de ABs marcados com o grupo fluorescente nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4yl (NBD), nomeadamente DCA-NBD e UDCA-NBD. Em primeiro lugar e com o objectivo de determinar os efeitos dos ABs citotóxicos e citoprotectores ao nível de membranas celulares, seleccionamos duas linhas celulares, células HEK293 e hepatócitos primários. As células HEK293 foram seleccionadas devido à simplicidade de cultura, enquanto os hepatócitos foram seleccionados por estarem já bastante estudados em relação ao papel citotóxico e citoprotector dos ABs e por apresentarem transportadores específicos para estes compostos na membrana plasmática (pelo que será expectável que a concentração intracelular destes compostos seja maior nestas células do que em células HEK293). Avaliámos o padrão de distribuição dos ABs marcados (DCA-NBD e UDCA-NBD) por microscopia confocal. Observou-se que ambos os ABs se ligam com elevada afinidade às membranas intracelulares e por outro lado apresentam baixa partição para a membrana plasmática (apenas cerca de 10 a 20% do AB fluorescente se encontrava na membrana plasmática). De forma a determinar de um modo mais detalhado a distribuição dos ABs em células HEK, recorremos a estudos de colocalização com marcadores de membranas, respectivamente Alexa 594-WGA (marcador da membrana plasmática) e Rodamina-123 (marcador de mitocôndrios). Tal como esperado tendo em conta os resultados anteriores, os ABs mostraram pouca colocalização com marcadores da membrana plasmática. A acumulação destas moléculas nas membranas intracelulares pode ser explicada pela elevada preferência destas moléculas por membranas lipídicas com baixa ordem membranar (baixo conteúdo em colesterol). Contudo, a remoção parcial de colesterol a partir da membrana plasmática não teve impacto na distribuição destas moléculas, sugerindo que a sua distribuição não é apelas ditada por diferenças ao nível da ordem membranar, podendo a ligação a proteínas específicas estar também envolvida na definição do padrão de distribuição destas moléculas em células HEK293. Os estudos de colocalização confirmam a partição significativa dos ABs-NBD para o mitocôndrio, existindo assim um elevado potencial destas moléculas para a modulação da estrutura da membrana mitocondrial e/ou interacção com proteínas mitocondriais. Estudos de fluidez membranar com base em imagiologia de tempos de vida de fluorescência (FLIM) com a sonda Di-4-ANEPPDHQ e polarização generalizada (GP) com Laurdan não detectaram qualquer influência por parte dos ABs não marcados ao nível desta propriedade membranar. Estes resultados poderão ser justificados por uma capacidade de internalização reduzida por parte dos ABs não marcados devido à presença de carga na molécula (baixa permeabilidade da membrana plasmática) e ausência de transportadores específicos para ABs na membrana plasmática de células HEK293. Neste caso a derivatização dos ácidos biliares, ao remover a carga do composto, potenciaria internalização celular do composto, tal como observado por microscopia de fluorescência. Os hepatócitos primários representam um modelo celular mais semelhante ao do sistema hepatobiliar in vivo. Nesta linha celular, observou-se que os ABs derivatizados encontram-se também distribuídos maioritariamente para organelos intracelulares, exibindo elevada partição para a membrana mitocondrial externa (MME) e baixa partição para a membrana plasmática, tal como observado para as células HEK293. Estudos utilizando novamente a sensibilidade do Laurdan à fluidez da membrana, comprovaram que tanto o DCA como o TUDCA não marcados tinham um efeito fluidificante nas membranas dos hepatócitos. No entanto, demonstramos aqui também que a fluidez das membranas de mitocôndrios isolados e de sistemas modelo mimetizando a sua composição são insensíveis à presença de ABs citoprotectores e citotóxicos, sugerindo que os efeitos do DCA e do TUDCA observados em hepatócitos não estão associados a uma alteração directa da estrutura da membrana mitocondrial. Assim, a capacidade de concentrações submicelares de ABs hidrófobos e apoptóticos de inibirem o efeito ordenador do colesterol em sistemas modelo de membranas que fora previamente observada, não parece ser eficaz no caso de membranas mitocondriais e do folheto externo da membrana plasmática, a concentrações fisiologicamente activas de ácidos biliares (~100 M). Se no caso das membranas mitocondriais, isto poderia estar relacionado com a baixa concentração de colesterol na membrana mitocondrial, já no caso do folheto externo da membrana mitocondrial, esta diferença deve estar relacionada com uma diferença da concentração efectiva na membrana de ABs citotóxicos. De facto, as alterações significativas na estrutura de sistemas modelo de membranas contendo colesterol, haviam sido observadas para incubações com 500 M de ABs. É assim de facto possível que os Abs modulem a estrutura da membrana em concentrações fisiologicamente activas, mas isso só ocorrerá por enriquecimento local em áreas específicas da membrana e não de forma generalizada. O motivo de ser observado um aumento da fluidez membranar após incubação com ABs em hepatócitos mas não em células HEK293, estará relacionado com o aumento de internalização de ácidos biliares em hepatócitos, devido à presença de transportadores específicos. Deste modo, a acção dos ABs será necessariamente intracelular e podemos concluir que o(s) alvo(s) celular(es) dos ácidos biliares citotóxicos serão: i) a estrutura do folheto interno da membrana plasmática (não acessível à AB extracelular não marcado em células HEK293, devido à ausência de transportadores), ii) a formação de poros na membrana plasmática ou mitocondrial, ou iii) activação de proteínas apoptóticas. Por outro lado, uma vez que foi já demonstrado que os ABs citoprotectores exibem uma eficiência mais baixa de partição para a membrana do que os seus homólogos citotóxicos, e são ineficazes na indução de alterações na fluidez de membranas lipídicas mesmo a altas concentrações submicelares, é de esperar que a sua actividade na regulação da apoptose, esteja relacionada com a inactivação de proteínas apoptóticas. Neste contexto, e uma vez que foi já observado que o UDCA induz uma diminuição da translocação da proteína Bax para os mitocôndrios, é importante definir se o UDCA interage directamente com a Bax. A activação da Bax por concentrações micelares de detergentes não aniónicos já é conhecida e envolve provavelmente uma alteração conformacional, de uma forma globular para uma estrutura com várias hélices α expostas e com possível inserção de alguns domínios no ambiente hidrófobo oferecido pelas micelas de detergente. Nos estudos incluídos nesta dissertação, os ABs citoprotectores UDCA e TUDCA mostraram elevada afinidade para a proteína recombinante Bax. Esta interacção não é apenas ditada por interacções hidrofóbicas, uma vez que ABs citotóxicos mais hidrófobos apresentam uma eficiência de associação muito menor. Além disso, a associação do UDCA aparenta ocorrer numa cavidade hidrofóbica da proteína e 2 moléculas de UDCA, no mínimo, são capazes de se ligar a cada monómero de Bax. Experiências de extinção da fluorescência intrínseca da Bax com iodeto foram também realizadas e os resultados sugerem que a ligação da Bax aos ABs citoprotectores resulta em alterações ao nível da estrutura da proteína. Uma alteração de conformação da proteína, pode resultar em diferenças no seu potencial apoptótico, por alteração da afinidade para parceiros apoptóticos ou anti-apoptóticos. Péptidos mimetizadores de domínios BH3 das proteínas Bid ou Bim, são activadores da forma apoptótica da Bax e foram utilizados de forma a analisar o efeito de concentrações anti-apoptóticas de UDCA na sua interacção com a Bax. O mecanismo de activação da Bax por estes péptidos envolve provavelmente a inserção numa cavidade hidrófoba da proteína, pelo que seria possível que houvesse competição entre os péptidos e UDCA pela associação com a proteína. Observou-se que, surpreendentemente, o UDCA aparenta promover a interacção entre a Bax e o BH3, promovendo a agregação do complexo. Muito recentemente, foi observado que micelas de detergentes específicos induzem dimerização da Bax apenas na presença de um péptido BH3. Estes dímeros foram considerados não-apoptóticos e não serão parte da via de activação da proteína. É possível que o UDCA actue através de um mecanismo semelhante, diminuindo a disponibilidade da Bax para formação de poros na membrana mitocondrial. Finalmente, estudos de partição da Bax para lipossomas mimetizadores da MME mostraram que a oligomerização da Bax aparenta ser dependente da densidade de proteína na membrana. Estudos adicionais serão necessários para caracterizar melhor o efeito de ácidos biliares neste processo. Concluindo, no conjunto de estudos que constituem esta dissertação foi observado que: i) ABs citoprotectores e citotóxicos não alteram de forma generalizada a estrutura do folheto externo da membrana plasmática, embora exista potencial para um efeito de aumento da fluidez localizado por parte dos ABs citotóxicos; ii) Após internalização em hepatócitos, tanto ABs citoprotectores e citotóxicos aumentaram a fluidez das membranas celulares, não sendo ainda claro quais os organelos mais afectados. iii) Ácidos biliares derivatizados apresentam afinidade por mitocôndrios, especialmente os ABs citoprotectores, o que sugere que a acção destas moléculas deverá estar associada a estes organelos. iv) ABs citoprotectores associam-se à proteína apoptótica Bax com elevada afinidade, enquanto o AB citotóxico aparenta apenas adsorver à proteína com muito menor afinidade. Este efeito poderá estar associado a uma alteração da capacidade apoptótica da proteína.Certain bile acids (BAs) have been shown to modulate apoptosis. Deoxycholic acid (DCA) is reported to induce apoptosis through the extrinsic and intrinsic pathways, while ursodeoxycholic acid (UDCA) and tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) have anti-apoptotic properties. The mechanisms by which BAs trigger opposite signaling effects remain elusive. We hypothesize that cellular membranes or apoptotic proteins constitute the targets for the action of BAs during apoptosis. Using fluorescence microscopy, we show that NBD fluorescent derivatives of DCA and UDCA are present at low concentrations in the plasma membrane of HEK293 and hepatocyte living cells, and are found enriched in mitochondrial membranes. Unlabeled BAs have no effect on the fluidity of intracellular and plasma membranes of HEK 293 cells at apoptotic concentrations. On the other hand, the membrane fluidity of living hepatocytes is sensitive to DCA and TUDCA, while the fluidity of isolated mitochondria membranes is not. It is likely that the effects of BAs on the membrane fluidity of hepatocytes are a consequence of increase internalization due to the presence of specific transporters. In this way, the modulation of membrane fluidity by BAs is likely carried out intracellularly. It is expected that the activity of cytoprotective BAs on apoptosis signaling is associated to inactivation of apoptotic proteins. Since, cytoprotective BAs have been shown to modulate incorporation of Bax (a pro-apoptotic protein) in mitochondria, this protein is a target in the search for the targets of cytoprotective/cytotoxic BAs. In this work, cytoprotective BAs were shown to bind with high affinity to Bax, and insert on a hydrophobic pocket, and inducing conformational and oligomerization changes on the protein. On the other hand, the cytotoxic DCA is shown to have limited interaction with Bax. It is possible that Bax oligomers formed in the presence of UDCA are analogous to Bax off-pathway dimers recently described.Fernandes, FábioCoutinho, Ana Isabel Abrantes, 1965-Repositório da Universidade de LisboaSousa, Tânia Patrícia Marques de2013-10-29T16:10:38Z20132013-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/9429TID:201281732engmetadata only accessinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:53:51Zoai:repositorio.ul.pt:10451/9429Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:33:39.006346Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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