Mammary organoids to study the functional impact of BRCA mutations

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Ferreira, Catarina Guerra
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/43551
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019
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spelling Mammary organoids to study the functional impact of BRCA mutationsBRCA1/2Breast cancerDNA repairiPSCOrganoidTeses de mestrado - 2019Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019Inheriting one single mutant copy of the breast cancer susceptibility (BRCA) genes is linked to an increased risk of developing early-onset breast and ovarian cancers. Mutation carriers are heterozygous, and tumors were initially reported to have lost the wild-type allele. However, this view has been questioned by a study showing that BRCA1 or BRCA2 loss of heterozygosity does not always occur in breast tumors, and, when it does occur, it can involve the mutant rather than the wild-type BRCA allele. Several additional studies using breast epithelial cells from BRCA1 carriers suggest that inactivation of a single BRCA1 allele is sufficient to cause genetic instability. Therefore, understanding the functional significance of BRCA hereditary mutations may open new paths for breast and ovarian cancer prevention and treatment strategies. Owing to increased awareness, early detection, and better treatment options available, breast cancer mortality rates have declined in recent years. Beyond prophylactic mastectomy, there are currently few options available for BRCA mutation carriers to help reduce their risk of developing breast cancer and systems to assess the contribution of BRCA1/2 heterozygous mutations for the initiation and progression of breast and ovarian cancers, are still lacking. To overcome these limitations, in this project we aim to evaluate the effect of heterozygous BRCA mutations within the DNA repair response. Skin fibroblasts from BRCA mutation carriers were used to investigate how such mutations affect the processing of double-strand breaks (DSBs). We also aim to derive induced pluripotent stem cells (iPSCs) from patient fibroblasts and induce their differentiation into the first mammary-like organoids harboring clinically relevant BRCA mutations. With this model system, we hope to contribute with a highly personalized approach to study the functional impact of BRCA mutations within the mammary epithelium, during breast developing, thus providing elucidation into the earliest stages of tumorigenesis.Estimativas indicam que anualmente cerca de 1,38 milhões de mulheres são diagnosticadas com cancro da mama. Destas, entre 69 000 e 138 000 adquirem a doença por predisposição genética, a maioria em idade jovem no momento do diagnóstico. Quando na base desta herança estão mutações heterozigóticas patogénicas nos genes BRCA, incluídas na Síndrome do Cancro Mama-Ovário, o risco para o desenvolvimento de cancro da mama ao longo da vida é de aproximadamente 80% e 75% em mulheres portadoras de mutações nos genes BRCA1 e BRCA2, respetivamente (contra um risco populacional de 12%). Como clássicos supressores de tumor, os genes BRCA codificam proteínas cujas funções são fundamentais para a manutenção da estabilidade genómica, nomeadamente através da sua participação em mecanismos responsáveis por promover uma reparação fidedigna das alterações que surgem durante a replicação semi-conservativa do DNA. Desde a sua descoberta, há três décadas atrás, que os genes BRCA despertaram a curiosidade científica e têm sido alvo de intensos estudos. Atualmente, novas funções são conhecidas – para além da ação complementar em mecanismos de reparação do DNA, estas proteínas estão também envolvidas na regulação da transcrição e na progressão do ciclo celular. À proteína BRCA1 atribui-se uma participação mais alargada nestes processos, fator que parece justificar o padrão de maior agressividade observado nos cancros associados às mutações germinativas no gene BRCA1, em comparação com aqueles associados às mutações no gene BRCA2. A mais recente descoberta nesta área de estudo acrescenta às funções executadas pela proteína BRCA1 um papel regulatório ao nível das populações de células estaminais do epitélio mamário. Adicionalmente, resultados de um estudo desenvolvido pela equipa de Jane Visvader, demonstraram que amostras de tecido mamário de indivíduos saudáveis portadores de mutação no gene BRCA1 apresentam expansão de uma população específica de progenitores mamários, ainda numa fase pré-neoplásica. Este subconjunto de células – os progenitores epiteliais luminares do epitélio mamário – é particularmente suscetível ao processo de transformação maligna, apresentando por isso um enorme potencial como alvo tanto para o tratamento como para a prevenção da doença em mulheres com alto risco para o desenvolvimento de cancro da mama associado ao gene BRCA1. Deste modo, estudar o início da formação e organização do epitélio mamário, em portadores de mutações germinativas nos genes BRCA, trará novas oportunidades para a identificação de mecanismos comprometidos nas fases mais precoces do desenvolvimento mamário e que poderão estar na base da oncogénese. Esta abordagem está em linha com um esforço coletivo de investigações que ambicionam caracterizar a globalidade das transformações celulares e eventos genéticos que ocorrem em tecidos pré-neoplásicos. Apesar de no presente momento a maioria do investimento para investigação em oncologia ser orientado para o tratamento de doenças malignas, a comunidade científica tem vindo a valorizar cada vez mais a necessidade de reverter esta tendência e privilegiar a prevenção primária e secundária de cancros. Uma vez que uma grande parte dos processos de tumorogénese ocorre de uma forma estocástica e independente da exposição a fatores de risco, que são o alvo da prevenção primária, é notória a necessidade de desenvolver ferramentas especificas e personalizadas para a deteção precoce de eventos oncogénicos. Nesse sentido, a identificação prospetiva e caracterização funcional das células alvo de transformação maligna em estadios pré-neoplásicos, apresenta-se como um pilar fundamental desta diretiva, já que o seu objetivo é testemunhar e compreender, com a maior resolução possível, as primeiras alterações que condicionam o aparecimento de cancros. No caso do cancro da mama e ovário associados a mutações genómicas herdáveis da linha germinativa nos genes supressores de tumor BRCA1 e BRCA2, a avaliação estrutural e operacional do tecido mamário saudável reveste-se de particular importância. Uma vez que estas mutações aumentam o risco para o aparecimento de cancro em tecidos específicos, compreender as alterações que ocorrem nos progenitores celulares e a sua descendência previamente à formação de tumores, pode vir a iluminar a perene questão da especificidade tecidual da oncogénese promovida por defeitos na expressão dos genes BRCA. Portanto, definir os primeiros eventos celulares que motivam alterações morfológicas ou de sinalização no tecido mamário diretamente resultantes de mutações nos genes BRCA é um objetivo crucial não apenas para a compreensão da etiologia e biopatogenese destes cancros, mas também para o desenvolvimento de métodos de prevenção e/ou rastreio precoce adequados e terapêuticas orientadas para as células de origem dos tumores ou eventos iniciadores da transformação maligna. Apesar de na sua maioria serem de ocorrência esporádica, resultantes de mutações somáticas não herdáveis, são os casos de cancro da mama hereditário que estão associados a maiores taxas de mortalidade. Não obstante, são os que apresentam simultaneamente o maior potencial preventivo e, como tal, várias têm sido as equipas de investigação a dedicar particular atenção às mutações hereditárias nos genes BRCA. Inicialmente, análises feitas a tumores retirados de pacientes com mutações germinativas nestes genes, apontavam para a necessidade da perda do alelo wild-type no tecido-alvo, através de um evento mutacional com a consequente inativação genética, para que o processo oncogénico se iniciasse. Esta visão, enquadrava os genes BRCA na clássica hipótese de Knudson para a inativação de genes supressores de tumor. Contudo, dados recentes indicam que a perda de heterozigotia não é um evento exclusivo e quando acontece, pode afetar o alelo herdado mutado, ao invés do alelo wild-type. Como tal, estudar a contribuição funcional das mutações BRCA será imperatório para compreender os mecanismos que contribuem para a formação e progressão dos tumores. No entanto, atualmente ainda não existem modelos eficazes e robustos que avaliem o impacto funcional destas mutações. Estudos funcionais têm-se baseado em modelos de murganho, linhas celulares malignas e células primárias imortalizadas. Embora os modelos animais permitam uma experimentação aprofundada, não refletem todas as características genéticas e a fisiologia dos tecidos humanos; portanto, não são ideais para o estudo do processo oncogénico. Do mesmo modo, as linhas celulares em cultura acumulam mutações com as passagens e não conseguem recapitular a fisiologia dos tecidos. Para superar estas limitações, neste projeto propusemo-nos a avaliar o impacto de alelos BRCA heterozigóticos ao nível dos mecanismos de reparação do DNA. Fibroblastos extraídos a partir de biopsias da pele colhidas de dadores saudáveis e de portadores de mutações heterozigóticas nos genes BRCA1 e BRCA2 foram assim testados quanto ao seu potencial para reparar quebras de dupla cadeia no DNA geradas por agentes genotóxicos. Paralelamente, a partir dos mesmos fibroblastos, induzimos a formação de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) com o intuito de as submeter a um protocolo de diferenciação mamária para a formação organoides mamários. Primeiramente, tínhamos como objetivo avaliar a predominância relativa das diferentes populações de progenitores mamários nas estruturas tridimensionais derivadas de iPSCs com mutações nos genes BRCA. No passado, tecido adulto e diferenciado de mastectomias preventivas e mamoplastias eletivas foi dissecado e os diferentes tipos de células e a sua prevalência no tecido mamário total foi avaliado retrospetivamente. Contudo, esta abordagem não permite uma caracterização funcional dos primeiros eventos genéticos ou celulares que estão na base das alterações morfológicas observadas no tecido mamário de portadores destas mutações. Mais ainda, tecido mamário adulto é sobretudo composto por células diferenciadas que não são o alvo da transformação maligna, já que esta ocorre em progenitores pautados por capacidade de autorrenovação e proliferação estaminal. Assim, a nossa abordagem pretende oferecer inovação tecnológica e protocolar, na medida em que é possível identificar e caracterizar a priori os progenitores derivados das iPSCs, sem o viés introduzido pela presença de células adultas diferenciadas. Concluindo, este projeto ambiciona gerar os primeiros organoides mamários derivados a partir de iPSCs portadoras de mutações nos genes BRCA e tirar proveito deste novo modelo experimental para caracterizar o impacto funcional in vitro destas mutações no desenvolvimento do epitélio mamário pré-neoplásico e testemunhar, pela primeira vez e em tempo real, a transformação maligna associada aos genes BRCA.Fonseca, Maria do Carmo Salazar Velez Roque daGonçalves, João Manuel BrazRepositório da Universidade de LisboaFerreira, Catarina Guerra2022-12-20T01:30:31Z2019-12-202019-11-222019-12-20T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/43551TID:202382222enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:44:04Zoai:repositorio.ul.pt:10451/43551Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:56:20.037689Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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