Characterization of TRIB2-mediated resistance to pharmacological inhibition of MEK

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Henriques, Vanessa Mendes
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.1/10705
Resumo: Chemoresistance and metastasis are the main reasons for treatment failure in melanoma patients. MAPK pathway is often hyperactivated in melanoma due to BRAF mutations. BRAF and MEK inhibitors revolutionized the standard-care of patients with advanced melanoma. Yet, patients develop resistance to these drugs very fast. Previous studies showed that Tribbles homolog 2 (TRIB2) is overexpressed in melanoma and confers resistance to chemotherapeutic and targeted drugs such as darcarbazin, PI3K and mTOR inhibitors. Furthermore, TRIB2 protein contains a MEK1 binding site. Taking this into account, we hypothesize that TRIB2 might confer resistance to MEK inhibition. In order to test our hypothesis, we generated isogenic melanoma cell lines with TRIB2 knockdown, using shRNA, and cells with TRIB2 depletion using CRISPR technique. Since the members of the Tribbles protein family might be functionally redundant and compensate for TRIB2 depletion, we decided to determine mRNA and protein levels of TRIB1, TRIB2 and TRIB3 using q-PCR and Western-Blot techniques, respectively, on a panel of melanoma and non-melanoma cell lines. We treated these isogenic cell lines with the MEK inhibitor Refametinib for 72h. The resistance was evaluated through cell death analysis, using cell counting based on trypan-blue and annexin V/ Propidium iodide staining. The isogenic cell lines were successfully established and determined that compensation of TRIB2 through TRIB1 or TRIB3 only plays a minor role. Importantly Refametinib treatment of melanoma cell lines with different levels of TRIB2 showed that cell death correlated with TRIB2 expression level suggesting that TRIB2 confers resistance to MEK inhibitors. Understanding the resistance mechanisms to the therapeutic agents can improve the outcomes of current therapies and contribute to the development of new therapeutic approaches.
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spelling Characterization of TRIB2-mediated resistance to pharmacological inhibition of MEKMelanomaTRIB2Cancro da peleDomínio/Área Científica::Ciências Médicas::Ciências da SaúdeChemoresistance and metastasis are the main reasons for treatment failure in melanoma patients. MAPK pathway is often hyperactivated in melanoma due to BRAF mutations. BRAF and MEK inhibitors revolutionized the standard-care of patients with advanced melanoma. Yet, patients develop resistance to these drugs very fast. Previous studies showed that Tribbles homolog 2 (TRIB2) is overexpressed in melanoma and confers resistance to chemotherapeutic and targeted drugs such as darcarbazin, PI3K and mTOR inhibitors. Furthermore, TRIB2 protein contains a MEK1 binding site. Taking this into account, we hypothesize that TRIB2 might confer resistance to MEK inhibition. In order to test our hypothesis, we generated isogenic melanoma cell lines with TRIB2 knockdown, using shRNA, and cells with TRIB2 depletion using CRISPR technique. Since the members of the Tribbles protein family might be functionally redundant and compensate for TRIB2 depletion, we decided to determine mRNA and protein levels of TRIB1, TRIB2 and TRIB3 using q-PCR and Western-Blot techniques, respectively, on a panel of melanoma and non-melanoma cell lines. We treated these isogenic cell lines with the MEK inhibitor Refametinib for 72h. The resistance was evaluated through cell death analysis, using cell counting based on trypan-blue and annexin V/ Propidium iodide staining. The isogenic cell lines were successfully established and determined that compensation of TRIB2 through TRIB1 or TRIB3 only plays a minor role. Importantly Refametinib treatment of melanoma cell lines with different levels of TRIB2 showed that cell death correlated with TRIB2 expression level suggesting that TRIB2 confers resistance to MEK inhibitors. Understanding the resistance mechanisms to the therapeutic agents can improve the outcomes of current therapies and contribute to the development of new therapeutic approaches.Melanoma é uma das formas mais agressivas do cancro da pele, sendo responsável por 80% das mortes para este tipo de cancro. Trata-se de um cancro é potencialmente metastático altamente resistente à terapia, levando a uma baixa taxa de sobrevivência. Existem duas vias de sinalização que estão comummente mutadas ou hiperactivas neste cancro, que contribuem para a proliferação celular e para a resistência a algumas terapias que atuam segundo as vias de sinalização PI3K e MAPK. A via-de-sinalização MAPK está frequentemente hiperactiva devido a mutação numa das serinas/treoninas kinases que compõem a via, BRAF. Vemurafenib foi o primeiro fármaco “alvo” aprovado pela FDA no melanoma, e sem dúvida revolucionou a terapia no melanoma. Trata-se de um inibidor do RAF, específico para a mutação V600E. Contudo, o melanoma é um cancro altamente heterogéneo e os pacientes eventualmente adquirem resistência a esta terapia. Por isso, têm se apostado no desenvolvimento de inibidores de MEK, que se localiza jusante de BRAF na via de sinalização. No entanto, os mecanismos de resistência continuam a ser das maiores preocupações, e das principais causas de morte nestes pacientes. Recentemente o nosso grupo identificou um novo mecanismo de resistência aos inibidores de PI3K/ mTOR, BEZ235, a inibidores de PI3K, BAY236, BAY439, inibidores do mTOR, Rapamycin e até mesmo a fármacos citotóxicos utilizados na quimioterapia (DTIC, gemcitabine and 5-fluorouracil) mediado por TRIB2. TRIB2 é uma pseudokinase que pertence à família de proteínas Tribbles, constituída por três elementos: TRIB1, TRIB2 e TRIB3, altamente conservados e homólogos. Na sua estrutura, TRIB2 possui um domínio pseudokinase, um domínio COP1 e um domínio de ligação às proteínas MAPK. Este estudo em que foi identificado um mecanismo de resistência mediado por TRIB2, demonstrou que TRIB2 se liga ao AKT via domínio COP1 ativando o AKT através da fosforilação da serina 473. Uma vez fosforilado e ativo, o AKT fosforila MDM2, que regula a atividade de p53, sendo considerado um oncogene. Quando MDM2 está fosforilado, fosforila o p53 enviando-o para degradação, bloqueando assim os mecanismos apoptóticos mediados por p53. Os autores demonstraram ainda que o AKT, uma vez ativado, fosforila também FOXO3a, um gene supressor de tumores, enviando o para degradação. Estudos anteriores demonstraram que a proteína TRIB2 é sobreexpressa em linhas celulares de melanoma e também em pacientes com melanoma. Considerando estas três principais observações: (a) TRIB2 na sua estrutura tem um domínio de ligação MAPK, (b) TRIB2 está sobreexpressa em Melanoma e (c) TRIB2 confere resistência aos inibidores de PI3K e mTOR, levantamos a hipótese de que TRIB2 confere também resistência a inibidores de MEK. TRIB2 pertence à família de proteínas tribbles que são altamente conservados entre espécies e apresentam alta homologia, podendo ter funções redundantes. Deste modo, antes de testarmos a nossa hipótese, decidimos averiguar os níveis de mRNA, através de q-PCR, e de proteína, através de um western blot, dos diferentes tribbles em linhas celulares de melanoma (G361, SK-Mel-28 e A375), osteossarcoma e HEK293T. Os resultados mostram que os níveis de mRNA de TRIB1 e TRIB2 são maiores em linhas celulares de melanoma comparativamente às linhas HEK293T e osteossarcoma, enquanto os de TRIB3 são mais elevados na linha celular HEK293T em relação às linhas celulares de melanoma e a de osteossarcoma. Os resultados de expressão de proteína mostram que todas os membros da família Tribbles são mais expressos nas linhas celulares de melanoma comparativamente às linhas celulares de Osteossarcoma e HEK293T. Para testar a nossa hipótese criámos dois sistemas diferentes em linhas celulares de melanoma: uma linha celular com níveis de expressão de TRIB2 mais reduzidos (knockdown) através de shRNA; outro onde eliminamos a expressão de TRIB2 utilizando a técnica CRISPR-Cas9. Para obtenção de knockdowns para TRIB2 transfetámos um plasmídeo que codifica com shRNA que codifica para TRIB2que é depois processado a small interference (si)RNA, e liga-se ao mRNA específico promovendo a sua degradação. O knockdown foi conseguido na linha celular G361. Nas restantes (SK-Mel-28 e A375) o controlo da técnica, shGFP interferiu também com a expressão de TRIB2. A técnica de CRISPR Cas9 baseia-se o sistema imune de E. coli: este sistema é constituído por single-guide RNA (sgRNA) e pela Cas9, uma nuclease que reconhece a sequência especifica e causa quebras duplas no DNA, que são depois corrigidas pelo sistema de reparação de material genético NHEJ levando a pequenas inserções ou deleções, culminando na perda de função do gene alvo. As células foram transfetadas com um plasmídeo que codifica para sgRNA e também para a Cas9. Foram testados vários clones para a obtenção de TRIB2 knockouts (KO), apenas uma parte está representada neste trabalho. Optámos por utilizar um KO de SK-Mel-28 (#8) e um de G361 (#14). Estas duas técnicas já tinham sido previamente validadas no nosso laboratório. O processo de obtenção de linhas celulares é bastante moroso, por isso decidimos otimizar algumas condições para depois testarmos a nossa hipótese de que TRIB2 confere resistência à inibição de MEK. Testámos duas concentrações para o inibidor de MEK (Refametinib) 100nM e 1μM onde é possível observar que ambas as concentrações inibem a via de sinalização e induzem morte celular. Optámos por usar as duas concentrações visto que utilizamos diferentes linhas celulares que se comportam de maneira distinta. Testámos também períodos curtos e longos de exposição ao fármaco, e verificámos que após 72 horas a via ainda está inibida. Deste modo, optámos por este período de incubação pois facilita a análise da morte celular. Testámos também plaquear diferentes números de células, para ter a certeza que estas não morriam por falta de espaço, mas sim devido ao inibidor, e observámos que o número de células plaqueadas não exerce influência na morte celular. Decidimos também averiguar qual o melhor tempo de incubação do controlo positivo para morte celular (etoposide) onde verificámos que 48horas de incubação causa mais morte celular. Após a obtenção das linhas celulares, as células foram submetidas ao tratamento com um inibidor de MEK, Refametinib, durante 72 horas. A morte celular foi avaliada através de contagem de células com trypan blue (células mortas surgem com citoplasma azul), através da técnica Annexin V / Propidium Iodide (PI), um método para identificar as células em apoptose que se baseia na integridade da membrana celular (as células em apoptose apresentam mudanças na morfologia da membrana celular que permite a estes componentes se ligarem aos alvos e emitir fluorescência) e apenas com PI. As técnicas Annexin V/PI e apenas marcação com PI foram analizadas no aparelho FACs Calibur utilizando o programa CellQuestPro. Todos os dados foram tratados/ analisados utilizando GraphPad Prism6. Os nossos resultados mostram que a morte celular se correlaciona com os níveis de expressão de TRIB2: nos vários sistemas utilizados, as células com reduzida ou sem expressão de TRIB2 morreram mais que as que tinham TRIB2, sugerindo que esta proteína pode, de algum modo, conferir resistência à inibição do MEK. Em suma, este trabalho mostra evidencias que sugerem que TRIB2 confere resistência à inibição do MEK tornando TRIB2 um alvo importante na terapia do melanoma. Estudos anteriores sugerem TRIB2 como um biomarcador no Melanoma, uma vez que este prediz a resposta clinica a uma dada terapia. Neste estudo demonstramos evidências que TRIB2 confere também resistência à inibição do MEK e que poderá ser útil no futuro, para diferenciar os doentes que poderão beneficiar da terapia. Um estudo aprofundado dos mecanismos de resistência aos fármacos contribui para o desenvolvimento e melhoria das terapias, aumento a esperança de vida dos doentes oncológicos.Link, WolfgangFerreira, BibianaSapientiaHenriques, Vanessa Mendes2018-06-21T15:09:02Z2017-11-1620172017-11-16T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.1/10705TID:201930781enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-24T10:22:22Zoai:sapientia.ualg.pt:10400.1/10705Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T20:02:19.634580Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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