Caracterização da Cinética de Inibição da isoforma Membranar da enzima Catecol-O-metiltransferase

• Autor(a) principal: Oliveira, Adriana Esteves
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.6/14066
• topic: Catecol-o-Metiltransferase; Cinética Enzimática; Dopamina; Inibidores e Doença de Parkinson; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Biotecnologia

A enzima catecol-O-metiltransferase (COMT, EC 2.2.1.6) desempenha um papel crucial na metilação de substratos como as catecolaminas e catecol estrogénios com uma estrutura catecólica. Devido à sua função biológica e possíveis de variações genéticas, sendo a mais conhecida, a substituição de um aminoácido valina por uma metionina, existem numerosos estudos que estabelecem uma ligação entre a COMT e a várias doenças cardiovasculares, carcinomas hormono dependentes e doenças neurológicas. Destas, destacam-se a esquizofrenia, transtorno bipolar, ansiedade e a Doença de Parkinson (DP). Assim a COMT, converteu-se num importante alvo terapêutico. Tipicamente, a DP é caracterizada pela progressiva degeneração dos neurónios dopaminérgicos no sistema nervoso central, especialmente na substância negra compacta do cérebro. A relevância da COMT no processo metabólico das catecolaminas e dos estrogénios catecólicos é vital no organismo humano, tendo se convertido, ao longo das últimas décadas, num alvo terapêutico de grande interesse clínico. Atualmente, a terapia mais eficaz para a DP é administração de L-Dopa em combinação com inibidores da COMT e os inibidores da Monoamino oxidase (MAO). No entanto, apesar da existência de um largo espectro de inibidores da COMT, estas moléculas apresentam diversas limitações, incluindo uma elevada toxicidade hepática e a dificuldade em atravessar a barreira hematoencefálica. Assim e de modo a caraterizar cineticamente a enzima Isoforma membranar da COMT (MBCOMT) recombinante humana na presença de moléculas inibitórias descritas pela primeira vez pelo nosso grupo de investigação, este estudo iniciou-se pela avaliação da interação da COMT com o seu principal substrato ao nível fisiológico, a dopamina, via a curva de saturação, após otimização da concentração de proteína total e do tempo de incubação para a realização dos vários ensaios enzimáticos, esses estudos permitiu o calculo de parâmetros cinéticos como a constante de afinidade (Km) que é a concentração de substrato em que a velocidade da reação enzimática atinge metade da velocidade máxima (Vmáx) e a constante catalítica (Kcat) indica-nos a eficiência da enzima em desempenhar a sua função biológica de converter o substrato em produto. Posteriormente, foram avaliadas as propriedades inibitórias de 3 compostos, o tolcapone (utilizado como controlo), zinc27985035 e o zinc78496496 (já descritos pelo grupo de investigação) e de uma formulação sujeita a um acordo de confidencialidade com a empresa NeuroSov. Sucintamente, as três moléculas apresentam valores de constante de inibição (Ki) que é a concentração de inibidor necessária para inibir metade da atividade máxima da enzima e de concentração inibitória média a 50% (IC50) é a concentração do inibidor na qual a velocidade da reação enzimática é 50% da reação enzimática sem inibidor, muito similares. Nomeadamente, o tolcapone apresentou um Ki igual a 6,59 nM e um IC50 de 10,18 nM, já o zinc27985035 possui um Ki de 3,26 nM e um IC50 de 12,53 nM e por fim, o zinc78496496 demonstrou um Ki de 4,91 nM e um IC50 de 12,84 nM. Paralelamente, a formulação apresenta um Ki e um IC50 muito superior em relação às moléculas em estudo, respetivamente, 50,16 µM e 12,37 µM. Este comportamento pode ser explicado pelo fato da formulação ter com alvo terapêutico a proteína NADPH oxidase 1 (Nox 1) e não especificamente para a COMT, promovendo de algum modo um efeito neuroprotetor. Em suma, os resultados aqui descritos caracterizam pela primeira vez e ao detalhe, a inibição da MBCOMT recombinante humana via a ação de duas moléculas recentemente descritas. A progressão dos estudos apresenta uma enorme potencialidade, via complementação dos ensaios enzimáticos de inibição em frações de MBCOMT com um grau de purificação mais elevado, na testagem dos compostos em linhas celulares dopaminérgicas e no redesign de novas moléculas com base no esqueleto das moléculas aqui descritas.