Novel yeast-based biosensor for environmental monitoring

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Miranda, Eduarda Maria Oliveira
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1822/82634
Resumo: Dissertação de mestrado em Genética Molecular
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spelling Novel yeast-based biosensor for environmental monitoringInovador biosensor de levedura para monitorização ambientalErgosterolTebuconazoleBiosensorFungicideS. cerevisiaeTebuconazolBiossensorFungicidaCiências Naturais::Ciências BiológicasDissertação de mestrado em Genética MolecularThe human population has been increasing worldwide, and, with it, food demand and consequently the need for higher agriculture yield. As approximately 35 % of the worldwide crops are lost to pests, pesticides have been used as a solution to this problem, increasing agricultural productivity from 42 to 70 %, improving food quality and quantity, at a reasonable price. However, there are human and environmental safety issues, since most of these chemical compounds affect both target and non-target organisms. With the interest to control and monitor pesticide usage, conventional assays have been used and can achieve low limits of detection, but are expensive, require trained technicians, and are time consuming. As an alternative to conventional methods, analytical devices that use biological molecules to measure reactions, either biological or chemical, have emerged, named biosensors. The yeast S. cerevisiae has been used as a model to develop biosensors, often relying on the activation of an inducible promoter that controls the transcription of a reporter gene, using fluorescence, bioluminescence, and colorimetry as measurable signals. Bearing this in mind, this project aimed to develop a yeast-based biosensor to detect the presence of a pesticide in aqueous samples, tebuconazole (TEB). TEB is a fungicide, i.e, it inhibits or eliminates fungal pests. TEB is a broad-spectrum, low-cost triazole fungicide that has been detected in vegetables, fruits, as well as wheat products. It is a 14α-demethylase inhibitor, blocking lanosterol conversion into ergosterol, thus causing a depletion of ergosterol, an essential component of the lipid membrane in fungi. The risk of this chemical in humans and ecosystems is well documented since the ergosterol pathway is conserved among several species. During the course of this work, four yeast strains were constructed, using specific promoters induced by TEB to drive the downstream expression of luciferase from a plasmid (expressed in S. cerevisiae BY4741), detected by bioluminescence assays. The system was further optimized and characterized, and the final chosen biosensor was able to detect 5 ng/ml of tebuconazole in a 6-hour treatment assay.A população humana tem vindo a aumentar e, com isso, aumenta a procura por alimento e, consequentemente, a necessidade de aumentar o rendimento agrícola. Como aproximadamente 35 % dos cultivos no mundo são perdidos devido a pestes, os pesticidas são usados como solução para este problema, aumentando a produtividade agrícola de 42 para 70 %, melhorando a qualidade do alimento e aumentando a sua quantidade, a um preço razoável. No entanto, problemas associados à saúde humana e ambiental começaram a surgir, já que estes compostos químicos afetam organismos alvo e não-alvo. Com o interesse em controlar e monitorizar o uso de pesticidas, ensaios convencionais de deteção têm vindo a ser usados, conseguindo atingir baixos limites de deteção, sendo, contudo, técnicas dispendiosas, morosas e que requerem técnicos especializados. Como alternativa aos métodos convencionais, surgiram os biossensores, dispositivos analíticos que usam moléculas biológicas para medir reações químicas ou biológicas. A levedura S. cerevisiae tem vindo a ser usada como modelo genético para o desenvolvimento de biossensores, muitas vezes baseando-se na ativação/repressão de um promotor indutível que controla a transcrição de um gene repórter, usando fluorescência, bioluminescência e colorimetria para medição de sinal. Posto isto, este projeto teve como objetivo desenvolver um biossensor de levedura, para detetar a presença de um pesticida em amostras aquáticas, o tebuconazol (TEB). TEB é um fungicida azólico, de amplo espetro e de baixo custo, que inibe ou elimina pestes fúngicas, sendo regularmente detetado em amostras de vegetais, frutas e trigo. Este composto químico é um inibidor da desmetilase 14α, bloqueando a conversão de lanosterol em ergosterol, causando assim uma depleção de ergosterol, um componente essencial da membrana lipídica nos fungos. O risco deste químico para os humanos e para os ecossistemas está bem documentado, uma vez que a via de síntese do ergosterol é conservada entre espécies. Durante este projeto, quatro estirpes de levedura foram construídas, usando promotores específicos, induzidos pelo TEB, para ativar a expressão da luciferase num plasmídeo (expresso em S. cerevisiae BY4741), detetado através de ensaios de bioluminescência. O sistema construído foi posteriormente otimizado e caracterizado, e o biossensor final selecionado foi capaz de detetar 5 ng/ml de TEB num ensaio de 6 horas de tratamento.Por fim, quero agradecer à Fundação para a Ciência e a Tecnologia, ao Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (através dos programas COMPETE2020 e PT2020), através do projeto de investigação FunG-Eye (POCI-01-0145-FEDER-029505) e os programas UID/BIA/04050/2019 e UIDB/04050/2020, pelo financiamento deste trabalho.Chaves, Susana Alexandra RodriguesUniversidade do MinhoMiranda, Eduarda Maria Oliveira2022-02-232022-02-23T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttps://hdl.handle.net/1822/82634eng203053168info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-21T11:57:18Zoai:repositorium.sdum.uminho.pt:1822/82634Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T18:46:57.422019Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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