Blood-brain barrier: role in brain metastasization of breast cancer
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| Data de Publicação: | 2019 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/44273 |
Resumo: | Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020 |
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Blood-brain barrier: role in brain metastasization of breast cancerBarreira hematoencefálicaMetástase cerebralCancro da mamaTransição endotelial-mesenquimalExtravasamentoTeses de mestrado - 2020Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020A falta de conhecimento profundo acerca dos mecanismos subjacentes ao extravasamento da barreira hematoencefálica (BHE) pelas células de cancro da mama, durante a cascata metastática, impede o desenvolvimento de terapias que previnam a formação de metástases cerebrais nos pacientes com cancro da mama. Entre todos os subtipos de cancro da mama, o cancro da mama triplo negativo é o que apresenta o menor número de opções terapêuticas, devido à falta de alvos moleculares definidos. Aliada a este facto, a restrita permeabilidade da BHE torna, atualmente, o tratamento de pacientes com metástases cerebrais num grande desafio, o que explica as pequenas taxas de sucesso e o mau prognóstico de cerca de 2 milhões de pessoas afetadas em todo o mundo. Neste sentido, torna-se urgente atuar previamente à colonização das células de cancro da mama no cérebro. Para tal, é necessário a realização de estudos adicionais que detalhem os mecanismos e os principais intervenientes moleculares na interação entre as células de cancro da mama e o endotélio cerebral, tendo como principais focos de estudo o estabelecimento de uma escala temporal que inclua cada etapa do processo de extravasamento (rolamento, adesão e transmigração/transposição), investigação detalhada do fenótipo de ambos os tipos celulares ao longo do tempo, determinação de alterações ao nível do endotélio e das células de cancro da mama, compreensão dos mecanismos de transposição da BHE e por fim, a elucidação dos marcadores moleculares envolvidos no processo de interação entre as células endoteliais da microvasculatura e as células de cancro da mama. Com base nestas necessidades, com este trabalho objetivamos estabelecer um perfil temporal e espacial das células de cancro da mama e células endoteliais ao longo do extravasamento, identificar os ligandos moleculares que intervém neste processo, pretende-se também avaliar a ocorrência da transição endotelial-mesenquimal ao nível do endotélio, caracterizar as vias de transposição da BHE usadas pelas células de cancro da mama e em simultâneo, avaliar a integridade da barreira ao longo do tempo. Para os nossos estudos, começámos por estabelecer um novo modelo humano de metastização de células de cancro da mama no cérebro in vitro, para o qual usámos um modelo simplificado da BHE in vitro, composto por células humanas endoteliais da microvasculatura cerebral (HBMEC) e ao qual adicionámos as células de adenocarcinoma humano (MDA-MB-231 Br4), uma linha celular de cancro da mama triplo negativo com propensão para a metastização no cérebro. Para avaliar temporal e espacialmente a interação entre as células endoteliais e tumorais, realizámos microscopia confocal e automatizada das culturas puras e mistas, que permitiu monitorizar e replicar a dinâmica celular ao longo de 24 h com aquisição de imagens a cada hora. Os nossos resultados mostraram que, após 1 h de interação, as células tumorais sofrem alterações morfológicas, evidenciadas por um aumento do seu perímetro e uma simultânea diminuição da circularidade e arredondamento, bem como a formação de extensões destas células, conseguindo estas uma maior área de contacto no endotélio. Todas estas características revelaram a aquisição de um fenótipo invasivo pelas células de cancro da mama nos tempos iniciais de interação entre os dois tipos celulares. Para além disso, recorrendo a softwares específicos, foi projetada a distância migrada pelas células, o que sugere que as células tumorais, durante o extravasamento, migraram maiores distâncias até às 3 h de interação entre os dois tipos celulares. Os nossos resultados demonstraram também que as células de cancro da mama, apresentam sobretudo um tipo de migração coletivo. Através da análise espacial das células de cancro da mama em relação à monocamadas endotelial, foram observadas duas posições distintas, designadas por “fora” quando as células tumorais se encontram completamente em cima da monocamada endotelial e “intercaladas” quando estas células se encontram parcial ou totalmente dentro da monocamada, definidos como estadio 1 e 2, respetivamente. Os resultados obtidos demonstraram que as células de cancro da mama rápida e eficientemente intercalam-se entre as células endoteliais, logo após 1 h de interação com as células endoteliais. Após 3 h, foi possível observar que algumas células de cancro da mama, migraram por baixo das células endoteliais. De seguida, com o intuito de caracterizar e identificar as proteínas envolvidas no processo de extravasamento, recorreu-se à técnica de citometria de fluxo. Este estudo permitiu inferir que o antigénio carcinoembrionário (CD66adecb) e a β1 integrina (CD29) não estão envolvidos neste processo, enquanto que o cluster de diferenciação 44 (CD44) e a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) revelaram ter um papel importante no extravasamento, ao nível das células endoteliais, contrariamente ao que acontece nas células malignas. De seguida, realizámos o mesmo tipo de análise para o transportador de glucose 1, de modo a perceber se a interação entre as células tumorais e endoteliais influência o metabolismo destas células, visto que é uma das principais fontes de energia de ambos os tipos celulares. Curiosamente, este estudo evidenciou que o extravasamento promove o aumento do número de células de cancro da mama que expressam este transportador. Relativamente às células endoteliais, a percentagem de células que expressam este transportador de glucose é semelhante nas culturas endoteliais e mistas ao longo do tempo, mas às 3 h de interação observou-se a formação de duas populações endoteliais distintas relativamente aos níveis de expressão deste transportador. De seguida, e para determinar se as células endoteliais sofrem um fenómeno recentemente descrito, designado por transição endotelial-mesenquimal, resultante da interação com as células malignas, foram feitos estudos de imunofluorescência, a partir dos quais avaliámos a expressão de reconhecido marcador mesenquimal, como a caderina neuronal e um marcador de migração celular, como a cinase de miosina de cadeia leve. De acordo com os resultados obtidos, após 3 h de interação entre as células endoteliais e tumorais observou-se um aumento da intensidade de fluorescência de ambos os marcadores estudados. Em simultâneo, estas células adquiriram uma morfologia alongada, evidenciando um fenótipo invasivo, que consequentemente facilita a ocorrência do extravasamento. Sendo este um processo altamente dinâmico, de seguida avaliámos a integridade da BHE através da monitorização das culturas endoteliais e mistas ao longo do tempo, o que revelou que a área coberta por células endoteliais diminui ao longo do tempo, também evidenciado pelo aparecimento de zonas com ausência de células endoteliais na monocamada. Através da marcação da β-catenina, uma das principais proteínas das junções aderentes, nas monocamadas endoteliais e culturas mistas, foi possível concluir que a disrupção da BHE está relacionada com a disrupção deste tipo de junções evidenciada primeiro pela formação de pequenos buracos na marcação, seguida da deslocalização desta proteína juncional da membrana para o citoplasma e núcleo e culmina na observação de grandes espaços entre as células endoteliais. As pontes de contacto entre células endoteliais que se mantiveram encontram-se altamente pressionadas. Curiosamente, ao longo deste estudo, de forma inesperada, percebemos que durante a interação entre os dois tipos celulares, as células de cancro da mama parecem incorporar componentes provenientes das células endoteliais. A partir de estudos adicionais, nos quais transferimos meios de cultura (provenientes de culturas mistas e endoteliais, cujas células endoteliais foram previamente marcadas com CellTracker™ Red CMTPX), observámos que as células de cancro da mama exibiram uma marcação vermelha, principalmente na região perinuclear. Curiosamente, apresentaram um maior número de vesiculas no seu interior, quando utilizado o meio de cultura endotelial. Paralelamente, a concentração de partículas em suspensão em cada um dos meios de cultura antes e após incubação com as culturas tumorais foi avaliada, utilizando o Nanosight. Estes estudos revelaram que após 3 h de incubação, as culturas mistas apresentam uma menor concentração de partículas quando comparadas com as culturas endoteliais. Para além disso, após a incubação das células tumorais com o meio de cultura endotelial, verificámos uma diminuição da concentração de micropartículas em suspensão, comparativamente à sua concentração antes da incubação. Estes resultados evidenciam assim a possível capacidade das células tumorais para incorporaram componentes das células endoteliais durante o extravasamento. No seu conjunto, estes estudos contribuíram para uma melhor compreensão do processo de extravasamento das células de cancro da mama triplo negativo através da BHE, a qual é essencial para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que previnam a transposição da BHE pelas células malignas e assim impedir a formação de metástases cerebrais.Insufficient understanding of the mechanisms behind blood-brain barrier (BBB) extravasation by breast cancer (BC) cells, during the metastatic cascade precludes the development of therapeutics to prevent brain metastasis formation in BC patients. Among all BC subtypes, the triple negative BC has the fewest therapeutic options due to the lack of well-defined molecular targets. Allied to this fact, BBB restricted permeability renders current treatment of patients with brain metastasis unsuccessful and account to the poor prognosis of the affected 2 million people worldwide. Therefore, it is emergent to act even before the BC cells colonize the brain parenchyma. For that, additional studies are required in order to detail the events and molecular players involved in the interplay between BC cells and brain endothelium. In particular, it is important to establish a temporal scale that comprises each step of extravasation, to detail the precise phenotype of both cell types, to determine the alterations occurring in brain endothelium, to examine the mechanism of BBB transposition and to elucidate the players involved in the malignant-endothelial interaction. To fill these gaps in the current knowledge, we outlined the following aims for this thesis: to establish a time and spatial-course profile of BC cells and BBB endothelial cells along extravasation, to identify the players involved in extravasation, to evaluate endothelial-mesenchymal transition occurrence in brain endothelium, to characterize the transmigration pathways used by BC cells for the BBB transposition and to evaluate the integrity of the barrier along this process. For our studies, we established a new and human BC brain metastasization in vitro model, composed by human brain microvascular endothelial cells (HBMEC), that mimics BBB, and human adenocarcinoma cells (MDA-MB-231 Br4), a triple negative BC cell line prone to metastasize in brain. To evaluate the interplay between the two cell types at temporal and spatial levels, live-cell imaging confocal microscopy and automated microscopy were performed in order to replicate and monitor the intercellular dynamics along 24 h, with images acquisition every hour. Our results showed that after 1 h, the malignant cells undergo morphological changes, revealed by an increase of their perimeter and a decrease in circularity and roundness, acquiring an invasive and migratory phenotype. These alterations were accompanied by the cytoplasmatic extensions development in BCCs. In addition, during this process, the BC cells showed the ability to quickly and efficiently intercalate the endothelial monolayer. Moreover, our data indicate that carcinoembryonic antigen (CD66adecb) and integrin-β1 (CD29) are not involved in extravasation, but the cluster of differentiation 44 (CD44) and intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) appears as extravasation players, particularly relevant in BMECs. On the other hand, this process promotes alterations in cells metabolism and an increase in the percentage of BC cells that express glucose transporter 1 was observed. Simultaneously, after 3 h of interaction, was observed two endothelial populations with different levels of glucose transporter 1 expression. In addition, during the extravasation process, the endothelial cells undergo the endothelial-mesenchymal transition, revealed by an increase of neuronal-cadherin and myosin light chain kinase expression, as well as the elongation of these cells, acquiring an invasive phenotype. Concomitantly, a progressive disruption of the endothelial monolayer integrity was evident and correlated with alterations in adherens junctions protein, β-catenin, allowing paracellular transmigration though the barrier. Interestingly, during the malignant-endothelial cells interaction, the BC cells seems to engulf endothelial cells components. Additional experiments using cell supernatants (both from CellTrackerTM Red-labelled endothelial cells and from mixed cultures) showed that BC cells exhibit a red labelling, further suggesting the engulfment of endothelial-secreted components. Allied to this fact, using a Nanosight tracking analysis, a decrease of microparticles concentration was more noticeable in mixed cultures comparatively to endothelial cultures was observed, as well as after the incubation of BC cells with endothelial culture medium. Together, these studies contribute for a better understanding of BC cells trafficking across brain microvascular endothelium, an essential step for the development of novel strategies to avoid extravasation of malignant cells into the brain and thus to prevent brain metastases formation.Brito, Maria Alexandra,1960-Gomes, Claúdio M.Repositório da Universidade de LisboaGarcia, Ana Rita da Costa2022-12-31T01:31:03Z202020192020-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/44273TID:202476839enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:45:13Zoai:repositorio.ul.pt:10451/44273Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:56:53.705931Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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