Molecular mechanism controlling epigenetic maintenance of centromere identity

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: David, Ana Filipa Claro, 1989-
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/9624
Resumo: Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
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spelling Molecular mechanism controlling epigenetic maintenance of centromere identityBiologia molecularCentrómeroCromatinaTeses de mestrado - 2013Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013The centromere is a specialized chromatin domain that directs kinetochore assembly and thus forms the site of interaction between DNA and the mitotic spindle. As such, it is required for faithful chromosome segregation during cell division. Centromere position and function are specified by an epigenetic, chromatin-based mechanism, thought to be driven by Centromere Protein A (CENP-A). This histone variant specifically replaces canonical H3 in centromeric nucleosomes and is known to template its own duplication. Its assembly into chromatin is tightly coupled to the cell cycle, ensuring the replenishment of the protein pool following its redistribution among daughter cells. Importantly, CENP-A has been shown to segregate in a semi-conservative manner, with no detectable loss for at least 3 cell divisions. Although currently no external factors are known to be responsible for CENP-A maintenance in human centromeres, this extreme stability suggests that such factors exist. The present study consists of a screen aimed at identifying novel regulators of CENP-A dynamics. We conceived and extensively optimized an experimental procedure that integrates the lentiviral-mediated delivery of shRNAs with in vivo labelling of specific CENP-A pools. This allowed us to quantify, by fluorescent microscopy, potential defects in both maintenance and loading of CENP-A, following depletion of a number of candidate factors. Knockdown of CENP-C, CENP-35, hKpd3, Asf1-b, Rsf-1 or H2AZ led to a reduction in the levels of nascent pools of CENP-A, suggesting the involvement of these proteins in the assembly pathway of the histone. All six proteins were shown to contribute to the deposition of newly-synthesized CENP-A specifically in G1 phase, with CENP-C appearing to have an additional role in CENP-A maintenance during subsequent cell cycle stages. Furthermore, our data argues for the existence of a sensing mechanism that allows cells to control the amount of CENP-A that is stably loaded into centromeric chromatin.O centrómero é o domínio funcional do cromossoma eucariótico que medeia a sua interacção com os microtúbulos do fuso mitótico. Como tal, é absolutamente necessário à correcta segregação do material genético aquando da divisão celular. Para que a integridade do genoma não seja comprometida, as células devem garantir a manutenção da cromatina centromérica e restringi-la a um único locus. Os centrómeros humanos encontram-se tipicamente associados a sequências de DNA repetitivo. No entanto, tais sequências não são necessárias ou suficientes à definição da posição do centrómero. Como em todos os eucariotas, esta cromatina especializada caracteriza-se antes pela presença da proteína CENP-A, uma variante da histona H3 que a substitui especificamente em todos os centrómeros activos. A manutenção destas estruturas constitui, de facto, um exemplo paradigmático de hereditariedade epigenética e um dos poucos casos em que a unidade de informação transmitida é comprovadamente conhecida. Os nucleossomas contendo CENP-A são, como o próprio DNA, replicados de forma semi-conservativa: cada célula-filha herda metade da população existente e usa-a como molde para a reconstituição da metade em falta. Estudos indicam que distribuição decorrente da divisão celular é mesmo o único evento de diluição de CENP-A, sendo a totalidade das moléculas incorporadas conservada nos centrómeros ao longo de pelo menos 3 gerações celulares. Isto é indicativo de uma estabilidade verdadeiramente notável, levantando a hipótese da existência de mecanismos que contribuam activamente para a manutenção de CENP-A nos centrómeros. Até hoje, não foi possível demonstrar o envolvimento de qualquer factor proteico num tal mecanismo de retenção. A hereditariedade dos centrómeros depende, por outro lado, do controlo da incorporação de CENP-A na cromatina. A montagem das moléculas sintetizadas de novo está estritamente acoplada ao ciclo celular, tendo lugar apenas na fase G1, e requer a partcipação da proteína HJURP e do complexo Mis18. A primeira é a chaperona específica que transporta moléculas de CENP-A até aos centrómeros; o segundo é tido como um factor de “licenciamento”, actuando a jusante de HJURP. Não obstante o conhecimento do envolvimento destes factores, o processo de incorporação de CENP-A e a sua regulação permanecem insuficientemente caracterizados. O presente estudo consiste num screen que teve por objectivo a identificação de novos reguladores da histona CENP-A em células humanas HeLa, de entre um conjunto de candidatos que emergiram essencialmente da literatura publicada. Em resumo, a estratégia adoptada passou pela detecção de alterações ao nível tanto da montagem de CENP-A como da sua retenção nos centrómeros, no seguimento do silenciamento da expressão de cada uma das proteínas de interesse por RNA de interferência. A expressão e processamento de shRNAs (small hairpin RNAs) em células vivas inibe a tradução dos mRNAs (messenger RNAs) a que estes sejam complementares. Adquirimos uma colecção de plasmídeos codificando shRNAs específicos, desenhados para ter como alvo os transcritos dos genes candidatos, e usámo-los para produzir vectores lentivirais. Após optimização do respectivo protocolo experimental, demonstrámos ser possível reduzir substancialmente o nível de expressão de proteínas-alvo mediante infecção com estes vírus e subsequente selecção das células infectadas. A enzima-suicida SNAP modifica-se covalentemente por aceitação de substratos específicos, potencialmente fluorescentes. A incubação de células que expressam CENP-A-SNAP com um destes substratos resulta, assim, na marcação irreversível desta proteína de fusão, in vivo. Por outro lado, a subsequente remoção do substrato garante que nenhuma da CENP-A-SNAP sintetizada posteriormente se torna fluorescente. Consequentemente, a eventual análise das células por microscopia de fluorescência permite detectar exclusivamente a população de moléculas presente no momento da incubação – e inferir a sua estabilidade nos centrómeros a partir desse momento. Se, alternativamente, as células forem primeiro incubadas com um substrato não fluorescente e mais tarde com o fluorescente, apenas a CENP-A-SNAP sintetizada no intervalo entre as duas marcações será detectável ao microscópio. Tal procedimento permite quantificar a população de CENP-A-SNAP nascente que é incorporada nos centrómeros, indicadora da eficiência do processo de montagem. Por análise comparativa de várias linhas celulares expressando CENP-A-SNAP, foi seleccionada aquela em que se mediram sinais fluorescentes de maior intensidade, na sequência dos procedimentos de marcação acima descritos. O screen foi inteiramente executado nestas células e pressupôs a sua infecção com vírus portadores de shRNAs, conjugando pois as tecnologias de RNA de interferência e marcação SNAP in vivo. O protocolo experimental final, alvo de um extenso processo de optimização, proporcionou uma avaliação sistemática dos efeitos que o silenciamento da expressão dos genes candidatos produz na retenção e montagem da histona CENP-A. As proteínas CENP-35, hKpd3 e Tip49a emergiram do screen como prováveis reguladores da incorporação de CENP-A na cromatina. O silenciamento da sua expressão conduziu a reduções significativas dos níveis de CENP-A-SNAP nascente detectados nos centrómeros, mas não afectou a estabilidade da população de moléculas previamente incorporadas. Resultados semelhantes foram obtidos na sequência do knockdown dos factores HJURP e Mis18BP1, cujo envolvimento no mecanismo de montagem é um facto já estabelecido. Por outro lado, a repressão da expressão de CENP-C reflectiu-se negativamente nos níveis centroméricos de ambas as populações de CENP-A-SNAP analisadas – a nascente e a pré-incorporada. Esta observação sugere que a proteína CENP-C contribui para a estabilidade da CENP-A nos centrómeros. Por último, knockown dos candidatos Rsf-1, Asf1-b ou H2AZ afectou a dinâmica da CENP-A de forma variável, mas ocasionalmente promissora. Juntamente com CENP-35, hKpd3 e CENP-C, estas proteínas formam a lista de candidatos a cujo estudo foi dada continuidade. Procurámos averiguar se as diminuições dos níveis centroméricos de CENP-A-SNAP nascente registadas no screen correspondiam efectivamente a deficiências no mecanismo de montagem. Uma interpretação alternativa dos resultados é a de que, por silenciamento da expressão de um factor importante para a maturação ou estabilização das histonas recém incorporadas, estas são perdidas já depois da fase G1. A marcação de CENP-A-SNAP nascente em culturas sincronizadas permitiu analisar esta população de moléculas em células bloqueadas na transição G1-S e, paralelamente, noutras a que foi permitida a progressão através das fases S e G2. Os resultados desta experiência confirmaram que o silenciamento da expressão de qualquer dos candidatos em estudo compromete a eficiência do processo de montagem ainda durante a fase G1. No entanto, a análise das células em fases subsequentes do ciclo celular revelou diferenças fundamentais ao nível da retenção de CENP-A-SNAP, levando ao agrupamento dos candidatos estudados em três classes distintas. Em células deficientes em Rsf-1 ou H2AZ, os níves centroméricos de CENP-A-SNAP quantificados na fase G2 estavam tão reduzidos em relação ao controlo como os registados ainda na fase G1. Deduz-se por isso que a estabilidade da histona não foi afectada. Noutra classe, o caso da proteína CENP-C foi o único em que a deficiência medida na transição G1-S se agravou com a progressão no ciclo celular. Esta observação sugere que este candidato regula tanto a montagem como a retenção de CENP-A, contribuindo decisivamente para a dinâmica desta proteína. Por fim, em células deficientes em Asf-1, CENP-35 ou hKpd3, a deficiência pareceu ser pelo menos parcialmente corrigida depois da fase G1, de forma que os níveis CENP-A-SNAP se aproximaram dos medidos em células controlo. O mesmo fenótipo foi obtido por knockdown de HJURP ou de Mis18BP1, o que sugere que esta compensação é produto de um mecanismo celular que permite controlar a quantidade de CENP-A que é estavelmente incorporada na cromatina. A existência de um tal mecanismo constitui um dado novo, acrescentando algo de substancial ao nosso conhecimento da hereditariedade epigenética dos centrómeros.Jansen, Lars E.Zilhão, Rita, 1959-Repositório da Universidade de LisboaDavid, Ana Filipa Claro, 1989-2013-12-04T18:57:42Z20132013-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/9624TID:201289539engmetadata only accessinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:54:10Zoai:repositorio.ul.pt:10451/9624Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:33:46.786358Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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