Role of EGF mediated laminin y2 chain in uterine cervix carcinoma
| Autor(a) principal: | |
|---|---|
| Data de Publicação: | 2017 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/30719 |
Resumo: | Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017 |
| id |
RCAP_c8f502b24afdc06e213273c4ae97481e |
|---|---|
| oai_identifier_str |
oai:repositorio.ul.pt:10451/30719 |
| network_acronym_str |
RCAP |
| network_name_str |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| repository_id_str |
7160 |
| spelling |
Role of EGF mediated laminin y2 chain in uterine cervix carcinomaCancro do colo do úteroMicroambiente tumoralFator de crescimento epidérmico (EGF)Laminina y2 (LAMC2)Proliferação e migração/invasão tumoralTeses de mestrado - 2017Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017A carcinogénese é um processo complexo e gradual de transformação pelo qual as células normais originam células com potencial neoplásico. Durante este processo, as células cancerígenas adquirem características de malignidade, que resultam da acumulação de várias mutações genéticas e alterações epigenéticas, levando assim, à ativação de oncogenes e inativação de genes supressores de tumores. Essas caraterísticas são designadas de hallmarks do cancro, sendo que as principais são: autossuficiência em relação aos sinais de crescimento, insensibilidade aos sinais de anti-crescimento, resistência à apoptose, elevado potencial replicativo, aumento do potencial angiogénico, evasão ao controlo imunitário, reprogramação metabólica e capacidade de invasão tecidular e metastização. O microambiente que envolve células cancerígenas também atua neste processo como uma rede funcional, que inclui células normais, fatores mediadores e componentes da matriz extracelular. O carcinoma do colo útero é o quarto tipo de cancro mais comum em mulheres em todo o mundo, sendo diagnosticados anualmente 528 000 novos casos. Em 2012 ocorreram 266 000 mortes relacionadas com este tipo carcinoma. Em Portugal, a taxa de incidência e mortalidade é relativamente alta, sendo a incidência de 10,8 e a mortalidade de 4,9 (taxas por 100.000 indivíduos por ano). Existem vários tipos histológicos de cancro do colo do útero, no entanto, os dois tipos mais comuns são os adenocarcinomas e os carcinomas pavimento-celulares, que compreendem 75-90 e 10-25% de todos os casos, respetivamente. O vírus do papiloma humano (HPV- human papillomavirus) é transmitido sexualmente e está bem estabelecido o seu papel como agente etiológico de vários tipos de cancro na área anogenital, incluindo o cancro de colo do útero. Aproximadamente 70% dos cancros do colo do útero estão diretamente associados aos sorotipos HPV16 e HPV18. Os genes E6 e E7 dos HPV de alto risco são oncogenes que desregulam o controlo do ciclo celular, podendo originar a transformação maligna das células. A matriz extracelular (ECM – extracellular matrix) é um componente chave do microambiente tumoral, sendo que nos últimos anos foi reconhecido o seu papel no processo carcinogénico. A ECM é composta por uma rede complexa de macromoléculas como colagénios, lamininas, fibronectinas e proteoglicanos. A sua principal função é o suporte tecidular, no entanto, também participa no controlo de eventos celulares como proliferação celular, adesão, migração, invasão e apoptose. As lamininas são glicoproteínas extracelulares de elevado peso molecular, sendo um dos principais componentes estruturais dos filamentos de ancoragem presentes nas membranas basais (BM - basement membrane). Todas as lamininas são proteínas heterotriméricas, que contêm três cadeias, denominadas α, β e . Atualmente estão descritas 16 lamininas com diferentes propriedades que resultam da conjugação das diferentes subunidades. A sua expressão é altamente regulada durante o desenvolvimento e a sua distribuição é tecido-específica. A laminina-332 (anteriormente denominada laminina 5) é um subtipo de laminina específica das BM dos epitélios, sendo a sua forma trimérica constituída pelas cadeias α3, β3 e 2. Nos tecidos normais, a laminina-332 interage com as integrinas 31, 61 e 64. Esta interceção é muito importante na adesão celular e por essa razão também está envolvida na migração e a invasão celular. Atualmente, a importância da laminina-332 é um assunto de destaque em diversas revisões bibliográficas, onde foram descritas novas funções estruturais e reguladoras desta macromolécula em vários carcinomas. Os tumores epiteliais (carcinomas) muitas vezes secretam grandes quantidades de laminina-332 e frequentemente expressam o seu ligando, a integrina 64. O aumento da expressão da laminina-332 tem sido observado em vários tipos de cancro, tendo sido considerado um fator de mau prognóstico. Foi também relacionado com a capacidade invasiva de vários tumores, como o carcinoma do colo do útero. De facto, sabe-se que a laminina-332 pode ativar vias de sinalização, uma vez que, níveis elevados desta proteína podem estimular a ativação da proteína cinase ativada por mitogénio (MAPK -mitogen activated protein kinases) e da fosfatidilinositol 3-cinase (PI3K –phosphatidylinositide 3-kinase), levando assim a um aumento da capacidade proliferativa e invasiva das células e à estimulação do crescimento tumoral. A laminina γ2 humana (LAMC2) é produto da expressão do gene LAMC2 e, como as outras cadeias, possui duas variantes transcricionais, resultantes do splicing alternativo do exão terminal 3'. No entanto, esta é a cadeia que confere especificidade ao trímero da laminin-332. Vários estudos mostraram o aumento da expressão da LAMC2 em cancros humanos, incluindo adenocarcinomas de estômago, pâncreas, tiroide, língua, colo-retal, pulmão, colo do útero, esófago, cabeça e pescoço, pele e pulmão. Observou-se que a acumulação citoplasmática da LAMC2 ocorre frequentemente na frente invasiva dos tumores e está associada a uma diminuição da sobrevivência dos doentes, à recidiva e formação de metástases. Relativamente ao cancro do colo do útero, alguns estudos mostraram que existe uma elevada expressão da cadeia LAMC2 em lesões microinvasivas e invasivas. Apesar da expressão da cadeia LAMC2 ter sido descrita em adenocarcinoma e em carcinomas pavimento-celulares do colo do útero, a sua acumulação ocorre predominantemente nos carcinomas pavimento-celulares. A formação e remodelação da ECM são ativamente reguladas por proteólise, que contribui para a homeostase dos tecidos. Contudo, no contexto tumoral, podem ocorrer desequilíbrios na proteólise, levando assim, a um crescimento tumoral desregulado, remodelação do tecido, inflamação, invasão e metastização. As MMPs (matrix metalloproteinases) são a família de protéases mais relevante associada à carcinogénese. Estas enzimas estão descritas como moduladoras do microambiente tumoral, uma vez que tem um papel crucial na regulação da matriz extracelular e na regulação de vias de sinalização relevantes para a progressão tumoral. As gelatinases MMP2 e MMP9 são as MMPs mais proeminentemente envolvidas na degradação da BM e, consequentemente, estão envolvidas no desenvolvimento tumoral e na formação de metástases. A hidrólise da cadeia γ2 por MMPs parece estar relacionada com o aumento da migração e invasão celular em carcinomas, uma vez que o processamento da cadeia LAMC2 afeta a dinâmica da adesão celular. A hidrólise da cadeia LAMC2 tem sido associada à atividade da MMP2 em cancros da mama e do colo do útero. O fator de crescimento epidérmico (EGF-epidermal growth factor) compreende onze polipéptidos, que compartilham um domínio EGF conservado, sendo esta uma das famílias de fatores de crescimento mais relevantes na progressão tumoral. Os vários ligandos podem ser produzidos quer por células cancerígenas quer por células do estroma, e a sua ligação a recetores de cinase de tirosina, conhecidos como recetores do EGF (EGFRs), estimulam vias de sinalização intracelulares específicas. A ativação dos recetores cinase tirosina culminam na ativação as cascatas enzimáticas envolvidas no crescimento e na sobrevivência das células, sendo que as vias MAPK e PI3K são as mais ativadas. Em cancro, a maioria das mutações que afetam o EGFR são mutações nonsense que promovem a sua ativação constitutiva, tornando a sua ativação independente da presença do ligando-EGF. Contudo, os recetores EGFR e HER2 estão frequentemente sobre-expressos, podendo funcionar como oncogenes. No cancro do colo do útero, o EGFR parece ser o recetor do EGF mais relevante. O domínio III da laminina γ2 apresenta segmentos EGF-like, que podem interagir com os recetores de EGF, nomeadamente o EGFR, levado assim à ativação das cinases da via das MAPK. O principal objetivo deste trabalho foi esclarecer o papel da LAMC2 de laminina-332 na progressão mediada por EGF de carcinomas do colo uterino, utilizando modelos in vitro de carcinoma pavimento-celular (SiHa) e adenocarcinoma (HeLa). Para atingir este objetivo foram delineados 5 objetivos específicos no sentido de verificar: i) o efeito do EGF no ciclo celular e na proliferação; (ii) a relevância da estimulação pelo EGF na expressão da LAMA3, LAMB3, LAMC2, LAMC1 e da LAMC3; (iii) a importância da LAMC2 no efeito do EGF no ciclo celular, proliferação e migração/invasão; (iv) o efeito do knockdown da LAMC2 na expressão da LAMC1 e da LAMC3, e (v) os fatores de transcrição envolvidos na regulação da expressão da LAMC2 e da LAMC1, dependente de EGF. Para a primeira abordagem, foram usadas bases de dados com amostras de doentes, que confirmaram, como já tinha sido descrito por outros autores, que a LAMC2 é sobre-expressa em vários tipos de cancro, incluindo o cancro do colo do útero. De forma a validar o efeito do EGF nos modelos in vitro, foram feitos ensaios de ciclo celular. Estes resultados mostraram que ambas as linhas celulares são responsivas ao EGF, uma vez que proliferam mais após o estímulo. Além disso, os nossos resultados mostraram ainda que a estimulação com EGF resulta num encurtamento da duração da primeira fase do ciclo celular, G0/G1, levando ao aumento do número de células nas fases S+G2/M. Este facto é acompanhado pelo aumento concomitante dos níveis da ciclina D1. Verificou-se ainda, que o EGF também regula a expressão de LAMC2 nas duas linhas celulares (SiHa-carcinoma pavimento-celular e HeLa-adenocarcinoma). Os ensaios de imunoprecipitação da cromatina, deram-nos bons indícios de que o FOXM1 (em SiHa) e o STAT3 (em HeLa) são fundamentais na regulação de LAMC2 pelo EGF. De forma a compreender melhor o papel da LAMC2 no cancro do colo do útero, a expressão da LAMC2 foi silenciada com shRNA. Os ensaios de proliferação após o knockdown da LAMC2 mostraram que o EGF estimula a proliferação independentemente da LAMC2 nas células SiHa, mas curiosamente nas células HeLa, o efeito proliferativo do EGF é mais eficiente na ausência de LAMC2. Além disso, o silenciamento LAMC2 suprime a capacidade migratória e invasiva das células SiHa, mas não parece afetar a migração das células HeLa. Relativamente à atividade das MMPs, ambas MMP2 e 9 são reguladas pelo EGF e os níveis de atividade de MMP9 estão relacionados com os níveis de LAMC2, em ambas as linhas celulares. A atividade da MMP2 também é afetada pelos níveis da LAMC2, contudo, é afetada de forma oposta comparando ambas as linhas celulares. Nas células SiHa, o knockdown da LAMC2 diminui a atividade de MMP2, enquanto que nas células HeLa a atividade desta enzima é aumentada. Assim, parece que o fenótipo maligno dos carcinomas pavimento-celulares é mais depende da expressão da LAMC2 do que os adenocarcinomas. Além disso, o knockdown da LAMC2 resultou no aumento da transcrição da LAMC1 nas células SiHa. Em condições controlo, o mesmo resultado foi observado para a LAMC3, contudo, este efeito desaparecia após o estímulo com EGF. Portanto, devia às alterações mais significativas ocorrerem na regulação da LAMC1 esta foi a cadeia que apresentou mais interesse ao nível da carcinogénese. No entanto, nas linhas celulares wild type (WT) sob a influência de EGF os níveis da LAMC1 apenas aumentaram nas células HeLa. Isto sugere que esta cadeia pode desempenhar um papel no fenótipo maligno moderado em adenocarcinoma (perfil de baixa invasão) em microambientes ricos em EGF. Novamente, o EGF também desempenha um papel na expressão de LAMC1 em ambas as linhas celulares, que parece estar associado aos fatores de transcrição FOXM1 e STAT3. O real significado desta regulação há que ser estudado mais em pormenor. De forma a tentar entender o papel da LAMC1 em contexto tumoral analisámos as mesmas bases de dados. Observámos, contudo, que a associação entre a expressão de LAMC1 e cancro do colo do útero é muito controversa. Assim, esta tese fornece informações relevantes sobre o papel da dinâmica regulatória da expressão da cadeia LAMC2 pelo EGF, podendo explicar o fenótipo mais agressivo do carcinoma pavimento-celular do cancro do colo do útero. Além disso, também sugere que a expressão da LAMC1 pode ser um elemento chave na progressão do cancro do colo do útero. Portanto, novas perspetivas de investigação podem ser delineadas a partir dos nossos resultados, de forma a compreendermos melhor os mecanismos moleculares subjacentes às várias formas de progressão inerentes aos diferentes tipos histológicos do cancro.Carcinogenesis is a multistep transformation process of normal cells to a neoplastic state. The microenvironment that surrounds cancer cells also act on malignant transformation as a functional network. Uterine cervix carcinoma is the fourth most common malignancy in women worldwide, being diagnosed annually 528 000 new cases and 266 000 related-deaths were observed in 2012. In Portugal, the incidence and mortality rate are relatively high, being the incidence 10.8 and mortality 4.9 cases per 100,000 persons per year. There are several histological types of uterine cervix cancer, however the two most common are squamous cell carcinomas and adenocarcinomas, comprising 75–90 and 10–25 % of all cases, respectively. In last years, it has been given more importance to tumor microenvironment as an important factor in carcinogenesis and disease progression. Extracellular matrix (ECM) is a major component of microenvironment, being composed by a complex network of glycoproteins such as collagens, laminins, fibronectins and proteoglycans. Laminins are a group of large extracellular glycoproteins and a major constituent of the basement membrane (BM) compartment of ECM. Laminin-332 is a specific subtype of laminins in the BM, having a trimeric structure composed by α3, β3 and 2 chains. High levels of laminin-332 expression were found in several human cancers, being considered a poor prognosis factor and have been related to the invasive ability of several tumors, such as uterine cervix cancer. Furthermore, the cytoplasmic accumulation of 2 chain (LAMC2) has been implicated in uterine carcinoma progression and has been frequently found at the invasive front of tumors, being associated with a poor survival, recurrence, and metastasis. The proteolytic processing of LAMC2 chain affects the dynamics of cellular adhesion and expose the EGF-like repeats of this molecule. EGF is considered the main growth factor acting on uterine cervix cancer. This work aims to clarify the EGF mediated role of LAMC2 of laminin-332 in the progression of uterine cervix carcinomas, using in vitro models of squamous cell carcinoma (SiHa) and adenocarcinoma (HeLa). In order to achieve our aim, we defined five specific aims to verify: (i) the role of EGF in cell cycle and proliferation; (ii) the effect of EGF stimulation in the expression of LAMA3, LAMB3, LAMC2, LAMC1 and LAMC3; (iii) the role of LAMC2 in EGF effect in cell cycle, proliferation and migration/invasion; (iv) the effect of LAMC2 knockdown in the expression of LAMC1 and LAMC3, and (v) the transcription factors involved in EGF dependent regulation of LAMC2 and LAMC1 expression. The analyses of human cancer databases confirmed that LAMC2 is upregulated in several cancer types and its expression is also increased in uterine cervix cancer. The cell cycle analyses revealed that both cell lines are EGF-responsive, so we confirmed that EGF is a suitable growth factor to stimulate uterine cervix cancer cells. Our results showed that EGF stimulation results in a shortened duration of G0/G1 cell cycle phase and in an increased percentage of cells in S+G2/M phases, concomitant with increased cyclin D1 levels. It was also found that EGF regulates the expression of LAMC2 in both cell lines (squamous cell carcinoma and adenocarcinoma). Both FOXM1 (in SiHa) and STAT3 (in HeLa) seems to be crucial for LAMC2 regulation. To investigate the role of LAMC2 in uterine cervix carcinoma, it was performed a LAMC2 silencing through shRNA technology. LAMC2 knockdown showed that EGF stimulates proliferation independently of LAMC2 in SiHa cells, but interestingly in HeLa the pro-proliferative effect of EGF is more efficient in the absence of LAMC2. Moreover, the LAMC2 silencing suppresses SiHa ability to migrate and invade. The matrix metalloproteinases (MMPs) are the most relevant family of proteinases involved in extracellular matrix turnover, acting as tumor microenvironment modulators. The activity of MMP2 and 9 is regulated by EGF and the levels of activity of MMP9 is related to LAMC2 levels, in both cell lines. In SiHa, the MMP2 activity is most affected by LAMC2 knockdown, which results in a decrease of MMP2 activity. So, it seems that the malignant phenotype of squamous cell carcinoma relies more on LAMC2 than the malignant phenotype of adenocarcinoma. LAMC1 association with cancer is controversial, however, the LAMC2 knockdown induces the transcription of LAMC1 in SiHa at mRNA level. Under control conditions, the same result was observed for LAMC3, although it had a lower significance which disappeared with EGF treatment. In wild type (WT) cell lines upon EGF stimulus the protein levels of LAMC1 increases in HeLa not in SiHa. It seems that this laminin gene can play a role in an EGF rich microenvironment, conferring a mild malignant phenotype in adenocarcinoma (low invasive profile). Again, EGF also plays a role in LAMC1 expression in SiHa and HeLa cells and these regulation seems to be associated to FOXM1 and STAT3, though the real meaning of this action must be unraveled. We believe this thesis gives relevant insights on the role of regulatory dynamics of LAMC2 by EGF that accounts for the uterine cervix squamous cell carcinoma aggressive phenotype; and it also pointed LAMC1 as a putative key element in uterine cervix cancer progression.Serpa, JacintaZilhão, Rita,1959-Repositório da Universidade de LisboaRamos, Cristiano Manuel Colaço2018-01-18T19:13:23Z201720172017-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/30719TID:201865262enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:23:42Zoai:repositorio.ul.pt:10451/30719Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:46:22.137627Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
| dc.title.none.fl_str_mv |
Role of EGF mediated laminin y2 chain in uterine cervix carcinoma |
| title |
Role of EGF mediated laminin y2 chain in uterine cervix carcinoma |
| spellingShingle |
Role of EGF mediated laminin y2 chain in uterine cervix carcinoma Ramos, Cristiano Manuel Colaço Cancro do colo do útero Microambiente tumoral Fator de crescimento epidérmico (EGF) Laminina y2 (LAMC2) Proliferação e migração/invasão tumoral Teses de mestrado - 2017 Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Biológicas |
| title_short |
Role of EGF mediated laminin y2 chain in uterine cervix carcinoma |
| title_full |
Role of EGF mediated laminin y2 chain in uterine cervix carcinoma |
| title_fullStr |
Role of EGF mediated laminin y2 chain in uterine cervix carcinoma |
| title_full_unstemmed |
Role of EGF mediated laminin y2 chain in uterine cervix carcinoma |
| title_sort |
Role of EGF mediated laminin y2 chain in uterine cervix carcinoma |
| author |
Ramos, Cristiano Manuel Colaço |
| author_facet |
Ramos, Cristiano Manuel Colaço |
| author_role |
author |
| dc.contributor.none.fl_str_mv |
Serpa, Jacinta Zilhão, Rita,1959- Repositório da Universidade de Lisboa |
| dc.contributor.author.fl_str_mv |
Ramos, Cristiano Manuel Colaço |
| dc.subject.por.fl_str_mv |
Cancro do colo do útero Microambiente tumoral Fator de crescimento epidérmico (EGF) Laminina y2 (LAMC2) Proliferação e migração/invasão tumoral Teses de mestrado - 2017 Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Biológicas |
| topic |
Cancro do colo do útero Microambiente tumoral Fator de crescimento epidérmico (EGF) Laminina y2 (LAMC2) Proliferação e migração/invasão tumoral Teses de mestrado - 2017 Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências Biológicas |
| description |
Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017 |
| publishDate |
2017 |
| dc.date.none.fl_str_mv |
2017 2017 2017-01-01T00:00:00Z 2018-01-18T19:13:23Z |
| dc.type.status.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| dc.type.driver.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| format |
masterThesis |
| status_str |
publishedVersion |
| dc.identifier.uri.fl_str_mv |
http://hdl.handle.net/10451/30719 TID:201865262 |
| url |
http://hdl.handle.net/10451/30719 |
| identifier_str_mv |
TID:201865262 |
| dc.language.iso.fl_str_mv |
eng |
| language |
eng |
| dc.rights.driver.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/openAccess |
| eu_rights_str_mv |
openAccess |
| dc.format.none.fl_str_mv |
application/pdf |
| dc.source.none.fl_str_mv |
reponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação instacron:RCAAP |
| instname_str |
Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação |
| instacron_str |
RCAAP |
| institution |
RCAAP |
| reponame_str |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| collection |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| repository.name.fl_str_mv |
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação |
| repository.mail.fl_str_mv |
|
| _version_ |
1799134387690799104 |