Molecular mechanisms underlying vascular problems in Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Sousa, Patrícia Martins de
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/51236
Resumo: Tese de Mestrado, Biologia Humana e Ambiente, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
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spelling Molecular mechanisms underlying vascular problems in Autosomal Dominant Polycystic Kidney DiseaseDoença Poliquística Renal Autossómica Dominante (ADPKD)Policistina-2 (PC2)Peixe-zebra (Danio rerio)Problemas vascularesHipertensãoTeses de mestrado - 2021Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de Mestrado, Biologia Humana e Ambiente, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA Doença Poliquística Renal Autossómica Dominante (ADPKD do inglês Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease) é uma doença crónica renal hereditária que afeta 1 em 400-1000 recém-nascidos em todo o mundo. É causada por mutações, maioritariamente, nos genes PKD1 (78% dos casos) e PKD2 (15% dos casos) que codificam as proteínas policistina-1 (PC1) e policistina-2 (PC2). Estas encontram-se localizadas em diversas estruturas celulares, porém, especialmente, a PC1 e a PC2 formam um complexo mecanossensorial na membrana dos cílios primários no epitélio renal, atuando respetivamente como um mecanossensor de estímulos extracelulares (como o fluxo de urina) e como um canal não seletivo de Ca2+. Este complexo é essencial para a homeostase do Ca2+ e, consequentemente, para a diferenciação e manutenção do epitélio renal. Adicionalmente, recentemente, também foram descobertos dois novos genes ligados a casos de ADPKD: GANAB e DNAJB11 (3% e 1,2% dos casos, respetivamente)¸ cujas proteínas se pensa estarem associadas à maturação e deslocação de proteínas transmembranares, particularmente a PC1. Na ADPKD, a disrupção destas proteínas leva a uma diminuição nos níveis basais de Ca2+ intracelular, provocando um aumento dos níveis de AMP cíclico (cAMP) e a desregulação de várias outras vias de sinalização, iniciando a cistogénese. Desta forma, desenvolvem-se múltiplos quistos renais cheios de fluído, cujo epitélio apresenta várias características patológicas, incluindo proliferação aumentada, apoptose aumentada, remodelação da matriz extracelular, fenótipo secretor, metabolismo desregulado e polaridade celular aberrante. A formação e inflação contínuas destes quistos, que constitui a principal manifestação clínica desta doença, destrói gradualmente o parênquima renal e, eventualmente, leva à insuficiência renal. A severidade da doença varia consoante o gene afetado, sendo que mutações no gene PKD1 estão associadas um fenótipo mais grave. No entanto, as manifestações da ADPKD não se limitam a este órgão; na verdade, é uma doença sistémica que leva a muitas complicações extrarrenais, como doença poliquística hepática, desenvolvimento de quistos no pâncreas, membrana aracnoide e vesícula seminal, diverticulose e diverticulite do cólon. Mas para além disto, esta doença também está associada a anomalias vasculares, que podem levar a aneurismas intracranianos, disseção e regurgitação da aorta, valvulopatias e hipertensão, que foram o foco deste projeto. Evidências na literatura mostram que a PC2 é expressa nas células endoteliais e musculares lisas vasculares, sugerindo uma importante função desta proteína no sistema cardiovascular. De facto, foi demonstrado que, nas células endoteliais vasculares, a ativação da PC2, pela tensão na parede dos vasos, resulta na dilatação do músculo liso e relaxamento vascular induzido pelo fluxo. Além disso, a PC2 também tem sido implicada na deteção da pressão de volume nas células do músculo liso vascular e na resposta miogénica. No entanto, a contribuição do canal PC2 para as alterações vasculares observadas em pacientes com ADPKD permanece incerta. Tendo em conta que a sequência e função desta policistina no peixe-zebra (Danio rerio) é altamente conservada com o ortólogo humano e dado o potencial deste organismo modelo para estudar a formação e doença da vasculatura, o nosso grupo postulou que a ausência de pkd2 levaria a anomalias vasculares nestes animais. Desta forma, escolhemos usar linhas de peixe-zebra para realizar as nossas observações in vivo da vasculatura embrionária, através de microscopia estereoscópica de fluorescência. Assim sendo, caracterizamos a vasculatura normal destes animais e as anomalias cardiovasculares causadas pela falta de Pkd2, usando algumas ferramentas. Primeiramente, usando um morfolino bloqueador de tradução do mRNA alvo, injetado em embriões (no estádio de uma célula) da linha Tg(fli1:eGFP; gata1a:DsRed)y1;sd2. Esta linha transgénica expressa GFP sob o controlo do promotor do gene fli1, assim como, dsRed sob o controlo do promotor do gene gata1a, e, portanto, marca células endoteliais vasculares e glóbulos vermelhos ao longo da embriogénese, respetivamente. O que nos permitiu discriminar anomalias na vasculatura relacionadas com a falta de Pkd2 até às 48 horas após a fertilização (hfp). E, por outro lado, gerando a linha mutante curly up (cup)tc321 × Tg(fli1:eGFP; gata1a:DsRed)y1;sd2, cruzando indivíduos heterozigóticos da linha mutante curly up (cup)tc321 com indivíduos da linha Tg(fli1:eGFP; gata1a:dsRed)y1;sd2. Os primeiros possuem uma mutação em cup, que codifica o ortólogo do peixe-zebra do gene PKD2 humano, levando a uma proteína truncada não-funcional. Esta linha permitiu-nos observar os embriões às 48, 72 e 96 hpf e, mais uma vez, com a marcação das células endoteliais vasculares e glóbulos vermelhos, para analisar anomalias vasculares. Os nossos resultados evidenciaram que os pkd2-morphants apresentavam várias anomalias cardiovasculares, o que foi consistente com o que era esperado e o que fora reportado em alguns trabalhos de investigação, que incluíam: defeitos in situ cardíacos, edema cardíaco, hemorragias intracranianas e hidrocefalia; que podem estar ligadas à interrupção das vias dependentes de pkd2 nos estágios iniciais de desenvolvimento, nomeadamente de vias responsáveis pela manutenção e função da vasculatura, que envolvem a matriz extracelular, a hipertensão e inflamação. Os defeitos observados no plexo da veia caudal e nos vasos intersegmentares não foram significativamente associados à falta de Pkd2, sugerindo um efeito off-target do morfolino ou possivelmente um ligeiro atraso no desenvolvimento associado ao uso de morfolino. No entanto, nem todos os fenótipos foram encontrados em cup-/- mutants, mesmo aquando da sua observação em estádios de desenvolvimento posteriores. De facto, o edema cardíaco foi o principal defeito cardiovascular detetado nestes animais. As razões por trás da ausência de alguns defeitos vasculares em cup-/- mutants que foram observados em pkd2-morphants, podem ser atribuídas a efeitos off-target do pkd2-augMO em pkd2-morphants ou à significativa contribuição materna de mRNA de pkd2 presente em cup-/- mutants já descrita na literatura, que pode atenuar fenótipos defeituosos. De facto, esta pode ser a principal contribuinte para as nossas observações em cup-/- mutants, visto que, à medida que a contribuição materna de Pkd2 foi progressivamente silenciada, o edema cardíaco foi agravando ao longo do desenvolvimento embrionário. Isto demonstrou a necessidade de uma investigação mais aprofundada dos mecanismos moleculares pelos quais o pkd2 poderá influenciar a vasculatura. De facto, para entender melhor os nossos resultados, será importante realizar no futuro ensaios de imunolocalização em vasos sanguíneos de pkd2-morphants e cup-/- mutants, e respetivos controlos assim como continuar a observar cup-/-mutants até aos 6 dias após a fertilização, momento em que morrem devido a complicações de malformação. Adicionalmente, foram realizadas medições do diâmetro da aorta dorsal em 5 diferentes localizações: 5º, 10º, 15º, 20º e 25º miótomo (unidade muscular do peixe-zebra). As medições do diâmetro da aorta dorsal de 48 hpf em ambos pkd2-morphants e cup-/- mutants mostraram que este vaso apresentava um calibre significativamente reduzido, o que parece ser causado por vasoconstrição. Esta diferença não foi verificada em estádios de desenvolvimento posteriores em cup-/- mutants, o que sugere que a Pkd2 poderá ter um papel mais determinante na vasculatura em estádios iniciais da embriogénese ou que as forças mecânicas que regulam a remodelação vascular após as 48 hpf são suficientes para esta ocorrer e que estes mecanismos podem ser independentes da função da Pkd2. Para além disto, os nossos resultados preliminares mostram claramente que a análise por microscopia confocal pode oferecer uma caracterização mais precisa destas anomalias. Concluindo, o nosso trabalho demonstra que a linha de peixe-zebra que criámos: curly up (cup)tc321 × Tg(fli1:eGFP; gata1a:DsRed)y1;sd2 é um ótimo modelo não só para observar e caracterizar problemas vasculares em vários estádios do desenvolvimento embrionário, mas também para estudar os mecanismos moleculares subjacentes a essas alterações devido à perda de pkd2.Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease (ADPKD) is an inherited chronic kidney disease that is estimated to affect 1 in 400-1000 newborn worldwide. It is caused by mutations mainly in PKD1 (78%) and PKD2 (15%). Recently, two additional genes were found to be linked to cases of ADPKD: GANAB and DNAJB11 The disruption of encoded proteins causes cytogenesis resulting in several fluid-filled kidney cysts, which is the main clinical manifestation of this disease. The continuous formation and inflation of these cysts, gradually destroy renal parenchyma and eventually leads to renal failure. However, ADPKD is not limited to this organ; indeed, it is a systemic disease that leads to many extrarenal complications. This project was focused on vascular abnormalities, which can lead to intracranial aneurysms, aorta dissection and regurgitation and hypertension. Evidence from literature has shown that Polycysctin-2 (PC2) is expressed in the endothelial and smooth muscle cells, suggesting an important function of this protein in the cardiovascular system. Still, the contribution of the PC2 channel to vascular changes observed in ADPKD remains unclear. Knowing that this polycystin sequence and function in zebrafish (Danio rerio) is highly conserved with human ortholog and the potential of this model to study vasculature formation and disease, we postulated that pkd2 loss would lead to vascular anomalies in these animals. We chose to use Tg(fli1:eGFP; gata1a:DsRed)y1;sd2 zebrafish line to perform our in vivo embryo vasculature observations. On the other hand, we studied the impact of the loss of pkd2 expression by using a pkd2 translational blocker morpholino and by generating the curly up (cup)tc321 × Tg(fli1:eGFP; gata1a:DsRed)y1;sd2 mutant line. Using these tools, we characterized the normal vasculature of these animals and the cardiovascular anomalies caused by the lack of Pkd2, by fluorescence stereomicroscopy. Our results showed that pkd2-morphants presented several cardiovascular anomalies: heart situs defects, cardiac edema, hemorrhages and hydrocephalus, which may be linked to the disruption of pkd2-dependent pathways in the early stages of development. However, not all phenotypes were found in cup-/- mutants, even when observing further developmental stages. Indeed, cardiac edema was the main cardiovascular defect detected in these animals. This supports the significant maternal contribution of pkd2 mRNA that has been described in the literature, which may attenuate defective phenotypes. We think that this may be the main contributor to our observations in cup-/- mutants, given that as the Pkd2 maternal contribution was progressively silenced, cardiac edema was aggravating throughout embryonic development. This shows the need for further investigation of molecular mechanisms by which pkd2 could influence vasculature. Indeed, to better understand our findings, it will be important to perform in the future immunolocalization assays in zebrafish blood vessels of both pkd2-morphants and cup-/- mutants, and respective controls. Additionally, 48 hpf dorsal aorta diameter measurements in both pkd2-morphants and cup-/- mutants showed that this vessel had a significant reduced caliber, which seems to be caused by vasoconstriction. Such difference was not verified at later developmental stages in cup-/- mutants which suggested either that Pkd2 had a more determinant role in the vasculature at earlier stages of embryogenesis or that the mechanical cues that regulate vascular remodeling after 48 hpf are sufficient for it to occur and may be independent of Pkd2 function. Our preliminary results clearly show that confocal microscopy analysis may offer us a more accurate characterization of these anomalies. Altogether, our work demonstrates that the zebrafish line we generated curly up (cup)tc321 × Tg(fli1:eGFP; gata1a:DsRed)y1;sd2 is a great model to not only observe and characterize vascular problems at several stages of embryonic development, but also to study the molecular mechanisms underlying these alterations due to pkd2 loss.Rosa, Mónica RoxoMartins, Francisco PinaRepositório da Universidade de LisboaSousa, Patrícia Martins de202120212024-10-06T00:00:00Z2021-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/51236TID:202934446enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:55:49Zoai:repositorio.ul.pt:10451/51236Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:02:34.145032Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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