Long non-coding RNAs as potential therapeutic targets in human breast cancer
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| Data de Publicação: | 2018 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/33872 |
Resumo: | Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018 |
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Long non-coding RNAs as potential therapeutic targets in human breast cancerCancro da mamaDanos no DNAp53NORADInstabilidade cromossómicaTeses de mestrado - 2018Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018O projeto ENCODE (Enciclopédia de Elementos do DNA) estima que apenas 2% do genoma humano codifica proteínas, enquanto 75% é transcrito em RNAs não codificantes de pequenas e de grandes dimensões. Cerca de 16.000 genes codificam mais de 28.000 RNAs longos não codificantes (lncRNAs), os quais têm sido alvo de interesse por participarem em diferentes processos biológicos (desenvolvimento, doenças, etc.). Geralmente, os lncRNAs são constituídos por mais de 200 nucleótidos, pouco conservados evolutivamente, pouco abundantes e heterogéneos. Recentemente foi descoberto um transcrito com 5,3 kb (LINC00657) que se destaca por ser muito conservado evolutivamente, muito abundante e constitutivamente expresso. Localiza-se predominantemente no citoplasma onde pode regular a estabilidade e tradução de RNAs mensageiros (mRNAs) e influenciar a sinalização celular. No núcleo pode organizar a estrutura subnuclear, regular a transcrição e interações cromossómicas. Após danos no DNA, este lncRNA é ativado de modo dependente de p53, sendo por isso denominado NORAD (RNA não codificante ativado por danos no DNA). NORAD, que contém 17 regiões de reconhecimento de proteínas de ligação ao RNA designadas Pumilio (sequência específica: UGUANAUA), captura uma quantidade significativa destas proteínas, impedindo que inibam a tradução de mRNAs alvo com os quais interagem através da sua região 3’, onde se encontra a sequência específica. Esses transcritos atuam ao nível da homeostasia da linha germinal, atividade neuronal, mitose, replicação e reparação do DNA. É importante referir que a interação entre o lncRNA NORAD e as proteínas Pumilio é induzida por outra proteína de ligação ao RNA, SAM68, que se liga a jusante das regiões de reconhecimento das proteínas Pumilio. Assim, na ausência de NORAD, as proteínas Pumilio são ativadas e inibem a tradução de mRNAs alvo, o que perturba a segregação dos cromossomas durante a mitose e provoca aneuploidia. Por sua vez, a aneuploidia pode contribuir para o ganho de funções por parte de oncogenes e a perda de funções por parte de genes supressores de tumores, originando tumores. Neste caso, NORAD atua como um gene supressor de tumores. Contudo, quando a acumulação de erros durante a mitose se torna demasiado elevada, as células não têm capacidade de resposta e morrem. Neste caso, NORAD atua como um oncogene. Estudos demonstraram a expressão de NORAD em vários tipos de cancro, no entanto, alguns resultados são contraditórios no que respeita à sua função. Nas células e tecidos dos cancros da mama, do esófago e do pâncreas detetaram-se níveis de expressão mais elevados em comparação com as respetivas células e tecidos normais, bem como uma correlação entre os seus níveis e o pior prognóstico dos pacientes. Além disso, depois da redução da expressão de NORAD, analisaram-se os efeitos nas propriedades das células e verificou-se redução da viabilidade, proliferação, migração e invasão in vitro e in vivo. Pelo contrário, nas células e tecidos do cancro do fígado detetaram-se níveis de expressão mais baixos em comparação com as respetivas células e tecidos normais, bem como uma correlação entre os seus níveis e o melhor prognóstico dos pacientes. Além disso, depois da redução da expressão de NORAD, analisaram-se os efeitos nas propriedades das células e verificou-se aumento da proliferação, ciclo celular, migração e invasão in vitro e in vivo. O presente estudo centra-se no cancro da mama por ser o mais frequentemente diagnosticado e o segundo mais mortífero em mulheres. É também uma doença complexa pois apresenta diferentes subtipos (luminal, HER2 positivo e basal) definidos de acordo com a presença de três recetores (ER, PR e HER2) e que apresentam diferentes características morfológicas e genéticas, resultando em diferentes tratamentos e prognósticos. Em primeiro lugar, determinaram-se os níveis basais de expressão de NORAD em células de cancro da mama (MCF-7, MDA-MB-231, 468 e 436) em comparação com células normais (MCF-10A) por RT-qPCR, tendo sido registados níveis de expressão mais elevados nas células de cancro da mama mais agressivas, isto é, negativas para os três recetores (MDA-MB-231, 468 e 436). A predominante localização citoplasmática deste lncRNA foi confirmada por smRNA FISH. Em segundo lugar, efetuou-se a redução da expressão de NORAD usando LNATM GapmeRs que atuam essencialmente ao nível do núcleo e siRNAs que atuam essencialmente ao nível do citoplasma. O resultado foi confirmado por RT-qPCR e por smRNA FISH. Em terceiro lugar, analisaram-se os efeitos da redução da expressão de NORAD nas propriedades tumorais da linha celular MDA-MB-231, e verificou-se inibição da proliferação através do ensaio da redução de alamarBlue® e inibição da migração através do ensaio de migração in vitro. A capacidade de proliferação e de metastização são características fundamentais do cancro, logo, estes resultados indicam que este lncRNA desempenha um papel importante na tumorigénese. De seguida, avaliou-se o efeito da combinação da redução da expressão de NORAD com quimioterapia. Para isso, utilizou-se a doxorrubicina que pertence à classe das antraciclinas, intercala-se entre pares de bases no DNA e inibe a topoisomerase II, provocando danos no DNA. Nestas condições, identificou-se uma redução do IC50 da doxorrubicina de 0,3779 μM para 0,05680 μM através do ensaio da redução de alamarBlue®, o que sugere que a redução da expressão de NORAD sensibiliza as células do cancro da mama à quimioterapia. Isto assume principal relevância em casos de resistência à quimioterapia. De acordo com este resultado, nas mesmas condições verificou-se um aumento da apoptose celular através de citometria de fluxo. De facto, a instabilidade cromossómica originada pela redução da expressão de NORAD e os danos no DNA originados pela doxorrubicina, levam à acumulação de demasiados erros genéticos que resultam na morte celular. Por outro lado, não se registaram alterações no ciclo celular para além da acumulação das células na fase G2 induzida pela doxorrubicina, porque este lncRNA não participa nesse tipo de resposta aos danos no DNA. No presente estudo é ainda destacado o gene supressor de tumores p53 como o guardião do genoma por ser ativado em condições de stress, ligar-se a proteínas envolvidas na reparação do DNA (XPB, RPA e rad51) e promover a transcrição de p21 que inibe cinases dependentes de ciclinas que regulam as transições G1-S e G2-M, induzindo arrastamento do ciclo celular. Em alternativa, quando os danos no DNA são demasiado elevados, ocorre apoptose celular através da libertação do citocromo c, da expressão de proteínas pro-apoptóticas da família BCL-2 (por exemplo, puma, noxa, bid e bax), de componentes da sinalização do recetor de morte celular (por exemplo, DR5 e Fas/CD95) ou da maquinaria efetora de morte celular (por exemplo, caspase-6, Apaf-1 e PIDD). De facto, perante a instabilidade cromossómica gerada pela redução da expressão de NORAD e os danos no DNA gerados pela doxorrubicina, detetou-se um aumento da expressão de p53 por RT-qPCR e western blot. Por fim, recorreu-se ao teste de Kaplan Meier para avaliar o efeito da expressão de NORAD na sobrevivência de pacientes com cancro da mama. Apenas para o subtipo basal que é o mais agressivo, se verificou uma correlação entre níveis de expressão de NORAD elevados e menor tempo de sobrevivência livre de recidiva. Os resultados obtidos permitem inferir que o lncRNA NORAD pode representar um biomarcador importante para o diagnóstico de cancro, o prognóstico do paciente e a resposta a terapias, e pode representar um alvo terapêutico. No futuro, aumentar a expressão de NORAD em células da mama normais (MCF-10A) e avaliar se existe aquisição de fenótipo tumoral, seria uma boa estratégia para esclarecer se este lncRNA é fundamental na tumorigénese.Long non-coding RNAs have emerged as regulators of diverse biological processes but little is known about their role in cancer. The recently discovered human lncRNA NORAD is induced after DNA damage in a p53-dependent manner and plays a critical role in the maintenance of genomic stability, since interacts with Pumilio proteins, limiting the repression of their target mRNAs involved in mitosis, DNA repair and replication. Therefore, NORAD inactivation causes chromosomal instability and aneuploidy, which contributes to accumulation of genetic abnormalities and tumorigenesis. However, severe chromosome mis-segregations end up with cell death, suggesting that NORAD may act as an oncogene and tumor suppressor gene. Moreover, this lncRNA has been detected in several types of cancer, including breast cancer, which is the most frequently diagnosed and the second-leading cause of cancer death in women. However, some studies present contradictory results relative to NORAD function in tumorigenesis. In the present study was found that NORAD expression is upregulated in a set of human epithelial breast cancer cell lines (MDA-MB-231, 436 and 468), which belong to the most aggressive triple negative subtype, in comparison to a non-malignant human mammary epithelial cell line (MCF-10A) by RT-qPCR. In agreement, was found that high NORAD expression levels in basal-like tumors are associated with poor prognosis, through Kaplan-Meier Plotter tool. In order to unravel the role of this lncRNA, tumor-relevant phenotypes were analyzed after its knockdown, using LNATM GapmeRs and siRNAs, in the MDA-MB-231 cell line. Cell proliferation inhibition determined by alamarBlue® reduction assay and cell migration inhibition determined by wound healing assay, suggests that NORAD acts as an oncogene. In addition, upon NORAD knockdown, was identified a shift in doxorubicin IC50 from 0.3779 μM to 0.05680 μM by alamarBlue® reduction assay caused by an increase in cell death, indicating sensitization to chemotherapy. In fact, chromosomal instability generated upon NORAD knockdown, in combination with DNA damage induced by doxorubicin results in severe chromosome mis-segregations, incompatible with cell viability. In contrast, no cell cycle change was identified by flow cytometry because this lncRNA is not required for these aspects of the DNA damage response. This study also highlights the role of p53, guardian of the genome, in the response to these stress conditions, since its expression levels increase (RT-qPCR and western blot), inducing cell cycle arrest or apoptosis. These results provide evidences that the lncRNA NORAD represents a tumor marker for disease diagnosis, patient prognosis or therapy response, and represents a therapeutic target in breast cancer.Jesus, Bruno Miguel Bernardes de,1980-Caria, Maria HelenaRepositório da Universidade de LisboaSilva, Ana Beatriz Domingues2020-03-26T01:30:18Z201820182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/33872TID:201911353enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:28:49Zoai:repositorio.ul.pt:10451/33872Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:48:42.772326Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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