Evaluation of immunoproteasome inhibition in the differentiation and maturation of dendritic cells
| Autor(a) principal: | |
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| Data de Publicação: | 2019 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/43380 |
Resumo: | Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019 |
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Evaluation of immunoproteasome inhibition in the differentiation and maturation of dendritic cellsSistema ubiquitina-proteassoma (UPS)ProteassomaImunoproteassomaDoençasCancroInibidoresCélulas dendríticasMonócitosDiferenciaçãoMaturação.Mestrado Integrado - 2019Ciências da SaúdeTrabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019Muitos processos fisiológicos e patológicos dependem do funcionamento do sistema ubiquitina-proteassoma (UPS). Este sistema é responsável pela degradação da maior parte das proteínas nas células eucarióticas. As proteínas são biomoléculas de nitrogénio de elevadas dimensões formadas por resíduos de aminoácidos e que possuem funções complexas que permitem o bom funcionamento do organismo. Deste modo, torna-se essencial manter a integridade celular das proteínas dentro de valores aceitáveis para garantir o seu correto funcionamento. Da incorreta conformação e agregação das proteínas podem surgir diversas doenças conhecidas como doenças conformacionais, entre as quais se destacam o cancro e doenças neurodegenerativas como Alzheimer e Parkinson. O proteassoma 26S é a forma constitutiva do proteassoma e é o local onde ocorre a degradação de proteínas marcadas com ubiquitina. Nos vertebrados podem ser encontradas três classes diferentes de proteassomas: timoproteassoma, imunoproteassoma e proteassoma constitutivo. O imunoproteassoma é maioritariamente expresso nas células que fazem parte do sistema imunitário, podendo, no entanto, também ser induzida a sua expressão noutro tipo de células durante processos de inflamação e na presença de certas citoquinas. Consequentemente, este tipo de proteassoma está geralmente associado a doenças inflamatórias, autoimunes, neurodegenerativas e até mesmo cancerígenas. Assim, o uso de inibidores do proteassoma de forma geral e específicos para o imunoproteassoma parece ser uma estratégia potencial de auxílio na terapia deste tipo de doenças. O objetivo principal desta tese de mestrado foi estudar o potencial efeito de inibidores do proteassoma e de diferentes subunidades do imunoproteassoma nos processos de diferenciação e ativação de células dendríticas primárias humanas. Para tal, utilizámos inibidores seletivos do (imuno)proteassoma: LU-001c, LU-001i, NC-001, LU-002c, LU-002i, LU-102, LU-025c e LU-015i, os quais foram fornecidos pelo Prof. Dr. H.S. Overkleeft (Leiden University, Netherlands). O primeiro segmento experimental realizado teve o objetivo de investigar o potencial efeito dos inibidores no processo de diferenciação das células dendríticas a partir de monócitos. Observámos que a presença dos inibidores levava a uma menor expressão dos marcadores HLA-DR e DC-SIGN, enquanto nenhum efeito se registava nos marcadores CD14, CD80 e CD86. Observámos também que este efeito era mais proeminente na presença de inibidores seletivos das subunidades catalíticas do imunoproteassoma. Tal indica que os inibidores do imunoproteassoma podem levar à supressão da diferenciação dos monócitos a células dendríticas imaturas e consequentemente a uma menor ativação das células T CD4+. Determinámos também os níveis de secreção por parte das células dendríticas das citoquinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α e IFN-γ na presença ou ausência de inibidores seletivos do imunoproteassoma. No entanto, nenhum efeito significativo foi observado com os inibidores e citoquinas estudados. Concluímos que no futuro outras citoquinas que se relacionem mais com as células dendríticas devem ser igualmente estudadas e investigadas. De seguida, realizámos duas experiências diferentes onde (i) tratámos os monócitos com inibidores apenas durante o seu processo de diferenciação a células dendríticas imaturas ou (ii) tratámos as células com inibidores durante os processos de diferenciação e maturação das células dendríticas. No primeiro caso, observámos resultados díspares na expressão dos marcadoes. Uma inibição das subunidades β5c e β5i simultãnea levou a uma diminuição notável da expressão dos marcadores CD80, CD86 e CD14, indicando uma menor maturação das células dendríticas. Contrariamente, perante um inibidor da subunidade β2i utilizado sozinho ou em conjunto com outros inibidores, observámos um ligeiro aumento da expressão do marcador DC-SIGN. Isto pode significar que diferentes subunidades catalíticas do imunoproteassoma estão envolvidas em vias intracelulares diferentes, o que explicar os diferentes fenótipos observados. Por outro lado, se os inibidores estavam presentes durante a diferenciação e maturação das células, foi possível observar um aumento significativo na expressão dos marcadores HLA-DR e DC-SIGN, enquanto CD80, CD86 e CD14 apenas foram afetados minimamente ou nada. Tal indica que a presença dos inibidores alterou as células dendríticas para um estado mais maduro. É de notar também, que de todos os inibidores utilizados durante este trabalho experimental, o inibidor da subunidade β5i, LU-015i, quando utilizado em combinação com outros inibidores parece ter um efeito inibidor sobre o imunoproteassoma mais potente. Deste modo, podemos afirmar que a modulação do (imuno)proteassoma parece ter um papel relevante no desenvolvimento das células dendríticas. No entanto, realçamos que são necessárias realizar mais repetições, modificações experimentais e diferentes testes no futuro de modo a melhor elucidar o papel do imunoproteassoma na diferenciação e maturação das células dendríticas.Many key physiological and pathological processes are managed through the ubiquitin-proteasome system (UPS). UPS is the main system for the degradation of proteins in eukaryotic cells. The standard form of the proteasome is the 26S proteasome, where degradation with ubiquitin-labelled proteins takes place. In vertebrates there can be found three major classes of proteasomes: the thymoproteasome, the immunoproteasome and the constitutive proteasome. The immunoproteasome is usually expressed in cells of the immune system. However, since its formation can be induced during inflammation and oxidative stress it is also found in other cell types. Studies show that it is involved in inflammatory, autoimmune and neurodegenerative diseases and also cancer. Thus, proteasome inhibitors seem to be a potential new strategy to use in the treatment of these pathologies. The main goal of this master’s thesis was to study the potential effect of the inhibition of different subunits of the (immuno)proteasome in the differentiation and activation process of primary human dendritic cells. For this purpose, we used (immuno)proteasome subunit selective inhibitors LU-001c, LU-001i, NC-001, LU-002c, LU-002i, LU-102, LU-025c, and LU-015i, which were kindly provided by Prof. Dr. H.S. Overkleeft (Leiden University, Netherlands). In the first segment, we addressed the potential effect of the inhibitors on the differentiation process of DCs from monocytes. We observed that the inhibitors caused a lower expression of HLA-DR and DC-SIGN, while no effect could be observed on the CD14, CD80 and CD86 expression. These effects were more prominent if inhibitors of the catalytic subunits of the immunoproteasome were used. This indicates that the immunoproteasome inhibitors could lead to suppression of the differentiation of monocytes to iDC and subsequent lower activation of CD4+ T cells. We also determined the levels of iDC secretion of IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α and IFN-γ in the presence or absence of the immunoproteasome inhibitors. No effect could be observed if the inhibitors were present. In the future, other cytokines and chemokines, which are more related to DCs, should be investigated. Next, we set up two experiments, where we either (i) treated the cells with inhibitors through the process of differentiation, but not through maturation or (ii) we treated the cells through both processes. In the first case, we obtain contraductory results. A sumultaneous inhibition of the β5c and β5i subunits lead to a notable decrease of the expression of CD80, CD86 e CD14 markers, indiciating a lower maturation of DCs. However, inhibition of the β2i subunit alone of with others inhibitiors caused a slight increase of the expression of DC-SIGN marker. This could mean that different catalytic subunits of the immunoproteasome regulate distinct intracellular pathways, which lead to a different phenotype. On the other hand, if inhibitors were present during differentiation and maturation, we could observe a significant increase in expression HLA-DR and DC-SIGN, while the expression profile of CD80, CD86 and CD14 was only minor or not at all affected. This indicates that the presence of the inhibitors shifted the dendritic cell to a more mature type. Of all the inhibitors used during the experimental work, it seems that β5i inhibitor LU-015i is the most potent to inhibit the immunoproteasome when used in combination with other inhibitors. Taken together, it seems that modulation of (immuno)proteasome plays a role in the development of DCs. However, further repeats, modifications and experimental setups are needed to elucidate the role of immunoproteasome in the development of DCs.Universidade de LjubljanaGonçalves, João Manuel BrazRepositório da Universidade de LisboaRodrigues, Raquel Alcarpe Coelho Gomes2020-05-04T22:58:46Z2019-12-202019-11-142019-12-20T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/43380TID:202475000enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:43:48Zoai:repositorio.ul.pt:10451/43380Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:56:11.978087Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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