pERK as a neuronal activity marker in Drosophila melanogaster

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silva, Sofia Alexandra Goulão da
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/48288
Resumo: Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2020
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spelling pERK as a neuronal activity marker in Drosophila melanogasterActividade neuronalFosforilação de ERKGlomérulo DC3Cérebro de DrosophilaTeses de mestrado - 2020Domínio/Área Científica::Ciências MédicasTese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2020Um dos principais desafios para os neurocientistas é compreender de que forma o cérebro dá origem a comportamentos observáveis, sendo fulcral mapear a actividade neuronal em circuitos conhecidos e bem definidos. Devido à simplicidade e rastreabilidade genética da mosca da fruta, os neurónios e respectivos circuitos são identificáveis entre animais, com um amplo conjunto de linhas transgénicas disponíveis para regular a actividade neuronal. Todavia, apesar de existir um kit experimental bastante sofisticado, os investigadores que utilizam a Drosophila melanogaster como modelo animal, não têm à sua disposição um bom marcador endógeno de actividade neuronal. Actualmente existem algumas técnicas para medir a actividade dos neurónios (e.g. electrofisiologia e influxo de cálcio), mas relativamente aos organismos invertebrados, as ferramentas disponíveis são escassas e com limitações muito concretas no estudo de comportamentos inatos e não confinados. É fundamental desenvolver uma ferramenta que nos permita aceder e monitorizar a actividade neuronal, a título rigoroso e preciso, em animais que se movem livremente e com uma expressão robusta e identificável no cérebro da mosca. Neste projecto, testámos a detecção imuno-histoquímica da proteína ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase) fosforilada, pERK - uma molécula-chave para a regulação dos eventos de plasticidade sináptica - como marcador de actividade neuronal no cérebro da Drosophila. A actividade dinâmica de ERK tem sido utilizada em diversos estudos com mamíferos e outros vertebrados (e.g. peixe-zebra), e foi comprovada a sua eficácia na marcação de neurónios activos, aquando da presença de um estímulo externo. No nosso paradigma, as moscas experimentais foram expostas durante 1 minuto a um odor atractivo, o farnesol, um composto presente em citrinos. As moscas do grupo controlo foram expostas durante 1 minuto a água destilada. 20 minutos após a exposição ao estímulo e controlo, os cérebros das moscas foram dissecados e rapidamente fixados. Em seguida, procedemos a uma avaliação qualitativa e imparcial de 3 observadores (modelo aplicado a todas experiências realizadas), que atribuíram pontuações para a ausência (0) ou presença (1) da expressão de pERK nos lóbulos das antenas das moscas. Os 3 observadores concluíram que havia uma maior percentagem de cérebros com expressão de pERK na condição experimental (88.9%), comparativamente com os cérebros controlo expostos a água destilada (15.1%). Estas primeiras observações sugeriram que o estímulo de farnesol aumenta a expressão de pERK nos lóbulos das antenas, o que suporta a nossa hipótese inicial de utilização de pERK como marcador de actividade neuronal, na sequência de um estímulo. Todavia, as classificações atribuídas pelos investigadores não foram concordantes para cada cérebro transversalmente, nas diferentes condições. Por essa razão, pareceu-nos fundamental uma abordagem alternativa de automatizada da fluorescência de pERK, que nos permitisse verificar as observações iniciais. Criámos então um método de quantificação automatizado, considerando como região de interesse o sinal de pERK obtido nos cérebros experimentais, expostos a farnesol. Foi estabelecido um sistema de coordenadas para aplicarmos a região de interesse, que apresentava expressão de pERK, e duas regiões background (adjacentes à região de interesse) aos cérebros das duas condições, garantindo assim a consistência entre todas as amostras analisados. Como resultado desta análise, verificámos níveis significativamente mais elevados de pERK na condição experimental, em comparação com o grupo controlo. Estes resultados encorajaram e motivaram uma investigação mais detalhada da activação neuronal nos lóbulos das antenas, em resposta ao estímulo de farnesol. Considerámos neste caso que seria importante verificar se esta activação neuronal nos lóbulos das antenas correspondia aos neurónios que expressam os receptores olfactivos 83c no glomérulo DC3, anteriormente identificados como sendo sensíveis ao farnesol. Para tal, recorremos ao sistema binário Gal4-UAS, anteriormente desenvolvido para induzir a expressão de genes, com a devida precisão em células específicas. Cruzámos então machos Or83c-Gal4 com fémeas virgens UAS-CD8::GFP. CD8 é uma proteína transmembranar e, por isso, a superfície dos neurónios Or83c vai estar marcada a verde, devido à fusão desta proteína com a green fluorescence protein (GFP). Desta forma, podemos facilmente identificar os neurónios 83c e medir a expressão de pERK em simultâneo. A análise qualitativa dos observadores mostrou um aumento dos níveis de expressão de pERK nos cérebros experimentais, comparativamente aos controlos. Relativamente à quantificação automatizada, a região de interesse e respectivos backgrounds foram obtidos com base na anatomia do glomérulo DC3. A análise estatística mostrou uma expressão elevada e significativa de pERK no glomérulo DC3, depois da estimulação com farnesol. Assim, os nossos resultados suportam a hipótese colocada inicialmente, e que sugere o aumento da expressão de pERK nos neurónios Or83c activos, na presença de farnesol. De acordo com as observações anteriores, considerámos que seria interessante perceber se a inibição ou activação artificial dos neurónios Or83c afectaria os níveis de expressão de pERK no glomérulo DC3. Para investigarmos estas questões, resolvemos silenciar e activar directamente os neurónios Or83c, com recurso a um canal hiperpolarizado de potássio, Kir2.1, e a uma proteína fotossensível constituinte de um canal de catiões, CsChrimson, respectivamente. A expressão de Kir2.1 e de CsChrimson está igualmente acoplada à proteína GFP, o que nos permitiu visualizar os neurónios Or83c e medir a expressão de pERK nestas células, à semelhança da experiência anterior. No protocolo de inibição dos neurónios 83c, verificámos inicialmente que não havia expressão de pERK nos cérebros controlo, expostos ao farnesol. Com base nos resultados das experiências anteriores seria expectável que os cérebros controlo, que correspondiam às gerações parentais (Or83c-Gal4 e 10xUAS-Kir2.1::eGFP), apresentassem expressão de pERK na presença do estímulo, o que não se verificou. A análise quantitativa revelou ainda resultados não significativos entre os cérebros experimentais e controlos. Para o protocolo de activação dos neurónios 83c, com recurso à proteína fotossensível CcChrimson, e considerando as possíveis variações da actividade neuronal em resposta à duração e dinâmicas da estimulação luminosa, estabelecemos primeiramente 2 protocolos distintos: luz pulsada (1 min, 2 Hz) e luz contínua (1 min). Foi ainda testado um terceiro protocolo, que consistia num estímulo mais longo (5 estímulos, 30 seg de luz, espaçados por 90 seg sem luz). Este último protocolo de activação foi estabelecido com base em estudos anteriores, que reportaram a capacidade de treinos espaçados para activar importantes cascatas de sinalização intracelulares, como a Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK). O ERK é uma molécula-chave desta cascata, e portanto questionámos se existiria uma expressão aumentada de pERK em função da resposta dos neurónios Or83c aos estímulos espaçados. Os resultados que obtivemos com as 3 manipulações artificiais não foram significativos entre moscas experimentais e controlos, sugerindo assim que os protocolos de activação não foram eficientes para activar os neurónios Or83 e aumentar a expressão de pERK no glomérulo DC3. Em suma, os nossos resultados mostram uma expressão aumentada de pERK, na presença de um estímulo externo, em neurónios olfactivos. No entanto, no seguimento das experiências de manipulação artificial de actividade neuronal, não foi possível confirmar a robustez da utilização de pERK como marcador de actividade neuronal na Drosophila. Não obstante, as nossas observações poderão abrir novos caminhos para estudar a actividade neuronal no cérebro da Drosophila e medir a actividade em neurónios específicos, envolvidos em diferentes comportamentos inatos e em contextos mais naturalistas. A identificação de neurónios envolvidos em diferentes condições pode ser crucial no estudo de outros paradigmas de função e actividade neuronal no cérebro das moscas, bem como permitir que se estabeleçam ligações com outros organismos. Acreditamos que este trabalho possa ser um passo firme nessa direcção. Todos os detalhes de execução experimental e análise foram partilhados com Dr.ª Marta Moita (e respectivo laboratório), e com a Dr.ª Isabel Campos. O total desenvolvimento experimental, recolha e processamento dos dados foi realizado por mim.In order to understand how the brain generates behavior, we need to map neural activity onto defined neuronal circuitry. Due to the simplicity and genetic tractability of the fruit fly, neurons and circuits are identifiable across animals, with a large and established set of transgenic lines. Although vast, the Drosophila experimental tool kit does not yet include a good endogenous marker of neuronal activity. In this project, we used immunohistochemical detection of phosphorylated Extracellular signal-Regulated Kinase (pERK) - a key molecule for synaptic plasticity regulation - as readout of neuronal activity in the Drosophila brain. Flies exposed to farnesol (an attractive citrus fruit compound) showed higher levels of pERK expression in the antennal lobes. Furthermore, pERK levels in Or83c-expressing neurons, which were previously implicated in processing the farnesol stimulus, were significantly increased after stimulation. We next exposed flies to farnesol, while expressing the inward rectifier potassium channel Kir 2.1 to silence Or83c neurons in the DC3 glomerulus. Additionally, we used a genetically encoded neuronal activator – CsChrimson – to artificially trigger those same neurons in the DC3 glomerulus. Our results from these manipulations were inconclusive and further analysis is required to explore pERK dynamics when we induced changes in Or83cexpressing neurons. In this study we show that, at least in some paradigms, pERK expression can be used as a marker of neuronal activity and, thereby, can increase our understanding about Drosophila circuits connectivity in the context of unrestrained behaviors. This tool can be quickly tested after stimulation to highlight the active neurons and brain regions involved in different behavioral responses. In the future, it will be interesting to see whether this endogenous marker can be applied to other paradigms, which should prove very useful as another tool to help map behavior onto neurons in the Drosophila brain. We hope this work encourages such future studies.Moita, MartaHenrique, DomingosRepositório da Universidade de LisboaSilva, Sofia Alexandra Goulão da2021-06-01T13:08:14Z2020-10-022020-10-02T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/48288TID:202544427enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:51:35Zoai:repositorio.ul.pt:10451/48288Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:00:11.890127Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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