Functional analysis of the Candida glabrata drug:H+ antiporters Dtr1 and Tpo4: role in stress resistance and virulence

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Romão, Daniela Ferreira
Data de Publicação: 2016
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/24646
Resumo: Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016
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spelling Functional analysis of the Candida glabrata drug:H+ antiporters Dtr1 and Tpo4: role in stress resistance and virulenceC. glabrataVirulênciaAntiportador Drug:H+Galleria mellonellaInfeçãoTeses de mestrado - 2016Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016Regista-se, nas últimas décadas, em estreita relação com o aumento do número de indivíduos imunocomprometidos, uma maior incidência de infeções mediadas por espécies de Candida [5]. Ainda que a maioria das infeções seja provocada por Candida albicans, é também observado que a emergência de infeções originadas por outras espécies do género Candida tem vindo a aumentar [5,6,9], sendo Candida glabrata uma das mais frequentemente isoladas e a segunda maior responsável pelos casos diagnosticados de candidiases[6,7,8]. A capacidade intrínseca de resistir às pressões exercidas pelas condições de stress impostas pelo hospedeiro é um dos factores que tem contribuído, seguramente, para o sucesso de Candida glabrata naquelas infeções [14,15]. Embora não seja capaz de formar hifas verdadeiras, como C. albicans, C. glabrata consegue, através da formação de biofilmes, aderir às células do hospedeiro, bem como a diferentes superfícies artificiais. Esta capacidade de adesão é, em grande parte, mediada pelas adesinas, nomeadamente as pertencentes à família EPA (Epithelial Adhesin Family), cujos membros CgEpa1, CgEpa6 e CgEpa7 foram já caracterizados [11]. A expressão de enzimas extracelulares, como proteases e hemolisinas, é igualmente crucial no processo de infeção, já que essas enzimas auxiliam a penetração nos tecidos, a evasão do sistema imunitário e a obtenção de nutrientes por parte daquela levedura [12,13]. C. glabrata mostrou, ainda, ser capaz de tolerar o confronto com células do sistema imunitário, como os macrófagos, usando-os como local imuno-privilegiado para a replicação, e com péptidos antimicrobianos, produzidos pelas células do hospedeiro para eliminar agentes patogénicos invasores [9,48]. Acresce dizer que a mesma levedura evidenciou, também, a capacidade de sofrer alterações cromossómicas, como perdas de cromossomas, rearranjos, translocações e fusões, que contribuem para uma alta diversidade entre a população que, de outra forma, poderia ser afetada pela sua incapacidade de reprodução sexuada [1,15]. Esta plasticidade genómica serve como mecanismo compensatório que lhe permite adaptar-se a um ambiente nefasto e em constante mudança, como o que poderá encontrar no hospedeiro. Como agravante, esta espécie é conhecida pela resistência adquirida a antifúngicos usados no tratamento das infeções [56,57]. Revela-se particularmente preocupante o facto dessa ocorrência se dar de forma cada vez mais acelerada, uma vez que, por exemplo, a resistência a equinocandinas e ao fluconazole, por parte de isolados de C. glabrata, aumentou de zero casos, entre 2001 a 2004, para 9.3% dos casos entre 2006-2010 [57]. Os mecanismos que explicam estas impressionantes capacidades de resistência a drogas e de resiliência dentro do hospedeiro, que têm vindo a ser estudados, podem, entre outros factores, ser mediados pela capacidade de extrusão de compostos tóxicos por bombas de efluxo, incluindo as pertencentes à superfamília MFS (Major Facilitator Superfamily), exaustivamente estudadas em S. cerevisiae [61,62,68]. Devido à proximidade entre S. cerevisiae e C. glabrata, muitos dos referidos transportadores identificados para S. cerevisiae têm homólogos em C. glabrata [5,61,62,68]. É o caso dos transportadores Dtr1 e Tpo4, nos quais se centra esta tese. Em S. cerevisiae, o transportador Dtr1, formado por 572 aminoácidos, é sintetizado no retículo endoplasmático e levado para a membrana do pró-esporo, a sua última localização [69]. Na ausência deste transportador, a composição da superfície do esporo é alterada e o transporte, quer da molécula bisformil-ditirosina, importante componente da superfície do esporo, quer de ácidos fracos, é fortemente alterado [69]. A tolerância a estes ácidos é muito importante para a proliferação eficaz, dentro do hospedeiro, das espécies de Candida, porque, no trato vaginal, existem concentrações significativas de ácido acético e lático. [111]. Sublinhe-se que relações sinergéticas entre a resistência a ácidos fracos e a antifúngicos têm vindo a ser descritas, quer para C. albicans quer para C. glabrata, reforçando, assim, a importância dos ácidos no contexto da virulência e da infeção [112,113]. No caso do transportador Tpo4, identificado em S. cerevisiae, observou-se ser determinante na resistência a poliaminas, pois regula a sua presença no citoplasma das células de levedura [71]. A assimilação de poliaminas tem vindo a ser estudada para outros transportadores da família Tpo, por exemplo o CgTpo3 de C. glabrata, envolvido na resistência a azóis e na extrusão de poliaminas para o meio extracelular [63]. A capacidade de inter-relação, entre a homeostase das poliaminas e a resistência a antifúngicos utilizados nas terapias, ganha especial relevo no contexto da infeção no trato urogenital humano, uma vez que aí existem altas concentrações de diferentes poliaminas. Infere-se, portanto, que a resistência a poliaminas pode ser importante para permitir a colonização do epitélio urogenital e melhorar a capacidade de virulência neste local adverso [63]. Trabalhos anteriores, desenvolvidos no grupo BSRG, demonstraram que ambos os transportadores, CgDtr1 e CgTpo4, pertencentes à família de Drug:H+ Antiporter, estavam relacionados com a letalidade observada no modelo de infeção Galleria mellonella. Os modelos de infeção, dentro dos quais se insere Galleria mellonella, têm-se revelado extremamente importantes no estudo dos mecanismos de infeção por parte de leveduras e bactérias. G. mellonella torna-se especialmente relevante porque tem um sistema imunitário muito semelhante àquele que é inato nos mamíferos, onde os hemócitos, semelhantes aos neutrófilos e macrófagos humanos, são capazes de fagocitar e matar agentes patogénicos pela produção de espécies reativas de oxigénio e enzimas líticas [56]. A sua fácil manipulação, a inexistência de constrangimentos no controlo do processo de inoculação, bem como os resultados promissores que advêm da utilização deste modelo, elegem-no como primeira opção, dentro do grupo BSRG, para estudar interações entre agentes patogénicos e o hospedeiro. Neste trabalho, a caracterização funcional do CgDtr1 e do CgTpo4 foi realizada focando-se no seu papel em respostas ao stresse, relevantes no contexto de infeção e de interação levedura-hospedeiro. A deleção do CgDTR1 revelou limitar a capacidade de proliferação das células de C. glabrata, após a injeção, na hemolinfa de larvas de G. mellonella. Adicionalmente, resultados para o mutante de deleção Δcgdtr1 mostraram concentrações ligeiramente menores de células viáveis dentro dos hemócitos, os correspondentes em G. mellonella aos macrófagos humanos, quando comparadas com as observadas nas células wild-type. Tomando estes resultados em consideração, foi estudado o papel do CgDtr1 na tolerância aos stresses associados à resposta mediada pelos macrófagos. O transportador CgDtr1 mostrou-se determinante na resistência ao stresse oxidativo e aos ácidos fracos, mas não aos antifúngicos. Foi descrito como localizado na membrana plasmática de C. glabrata, usando fusão com a GFP, e implicado no decréscimo de acumulação de ácido acético, marcado radioativamente. O transportador CgTPO4, não tendo revelado afetar a proliferação de C. glabrata na hemolinfa do modelo G. mellonella, foi descrito como interveniente na capacidade de resistência à histatina-5, um péptido antimicrobiano humano, semelhante àqueles que fazem parte do sistema imunitário primário das larvas de G. mellonella. Tendo em conta a semelhança com o seu homólogo em S. cerevisiae, o CgTpo4 foi também descrito como envolvido na resistência a poliaminas, mas não a antifúngicos. Este transportador foi localizado na membrana plasmática em C. glabrata, usando fusão com GFP, e associado ao decréscimo de acumulação de espermidina, marcada radioativamente. Os resultados obtidos no decurso deste trabalho sugerem que o CgDtr1, na virulência de C. glabrata em G.mellonella, está associado à sobrevivência da levedura dentro dos hemócitos, pelo controlo da concentração intracelular de ácidos fracos, ao passo que o CgTpo4 está relacionado com a capacidade de resistência a péptidos antimicrobianos. Estes resultados são promissores na medida em que contribuem para o esclarecimento dos mecanismos intervenientes na relação de C. glabrata com o hospedeiro, permitindo, assim, redirecionar o estudo dessas relações e, consequentemente, equacionar novas possibilidades terapêuticas, preferencialmente mais focadas nas relações que, comprovadamente, existem entre o hospedeiro e o agente patogénico.The incidence of Candida sp. related infections has been growing significantly over the last couple of decades, mainly due to the increasing numbers of immunocompromised individuals. Within these species, Candida glabrata has become the second most frequent cause of candidiasis. Part of the success of this species is due to its intrinsic ability to withstand the pressure exerted by antifungal drugs and several stress conditions imposed by the host. Earlier work performed at the BSRG has shown that the CgDtr1 and CgTpo4 transporters, from the Drug:H+ Antiporter family, are involved in C. glabrata virulence outcome in the Galleria mellonella infection model. In this work, the functional characterization of CgDtr1 and CgTpo4 was undertaken, with focus on their role in infection-relevant stress responses and in host-pathogen interaction. The deletion of CgDTR1 was found to limit the ability of C. glabrata cells to proliferate, upon injection, in the haemolymph of the G. mellonella larvae. Additionally, the Δcgdtr1 deletion mutant was found to reach a slightly lower concentration of viable cells inside haemocytes, the G. mellonella correspondent to human macrophages, when compared to the wild-type cells. Taking these results into consideration, the role of CgDtr1 in the tolerance to macrophage associate stresses was studied. CgDtr1 was found to be a determinant of resistance to oxidative and weak acid stress, but not to antifungal drugs. This transporter was found to be localized in the C. glabrata plasma membrane, using a GFP fusion, and to mediate the decreased accumulation of radiolabelled acetate. CgTPO4 was not found to affect C. glabrata proliferation in G. mellonella haemolymph, but was found to confer resistance to histatin-5, a human antimicrobial peptide, similar to those found to be part of the primary immune-system of G. mellonella larvae. Similar to its S. cerevisiae homolog, CgTpo4 was also found to confer resistance to polyamines, but not to antifungal drugs. This transporter was found to be localized in the C. glabrata plasma membrane, using a GFP fusion, and to mediate the decreased accumulation of radiolabelled spermidine. Altogether, these results suggest that the role of the CgDtr1 in C. glabrata virulence against G. mellonella is associated to its contribution to survival inside haemocytes, through the control of intracellular concentration of weak acids, while that of CgTpo4 appears to be related to its role in antimicrobial peptide resistance.Teixeira, Miguel Nobre Parreira CachoBarata, Margarida,1958-Repositório da Universidade de LisboaRomão, Daniela Ferreira2016-09-08T10:08:43Z201620162016-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/24646TID:201330423enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:13:41Zoai:repositorio.ul.pt:10451/24646Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:41:44.794564Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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