Blocking HIV at cell entry: innovative exploitation of the interaction between membranes and next generation drugs: single domain antibodies, peptides and photoactivatable oxidants

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Figueira, Tiago Nascimento
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/9621
Resumo: Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013
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spelling Blocking HIV at cell entry: innovative exploitation of the interaction between membranes and next generation drugs: single domain antibodies, peptides and photoactivatable oxidantsVIHInibidores de fusãoMembranas lipídicasInteracçãoBiodistribuiçãoTeses de mestrado - 2013Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013Desde a sua descoberta, o Vírus da Imunodeficiência Humana (VIH) tornou-se uma das principais preocupações da comunidade médica e científica mundial. Mais de 34 milhões de pessoas encontram-se infectadas em todo o mundo, sob o risco de contrair o Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA). Este estado imunocomprometido resulta de dois pontos críticos da patogenicidade lentiviral: a deplecção de linfócitos T CD4+ circulantes para níveis incapazes de combater infecções oportunistas e a persistência de reservatórios virais em macrófagos e células dendríticas.. O ciclo de vida do VIH revela alvos favoráveis no combate à progressão infecciosa. Ao entrar em contacto com as células do hospedeiro, o reconhecimento de receptores e co-receptores específicos desencadeia a fusão das membranas celular e viral com libertação do conteúdo para o citoplasma das células do hospedeiro. No interior da célula, o material genético é processado e integrado no genoma do indivíduo, a partir do qual poderão ser traduzidas novas proteínas virais. Da membrana do hospedeiro emergem novos viriões posteriormente activados por maturação proteolítica. Cada vírus apresenta um lipidoma sob a forma de bicamada lipídica que engloba e envolve o proteoma e genoma viral. Apesar de já se encontrarem disponíveis inibidores para as diversas fases do processo de infecção, as potencialidades terapeuticas destas drogas não permitem a eliminação total do vírus, mesmo sob a elevada carga farmacológica dos regimes de terapia antiretroviral (TARV). Os inibidores de entrada do VIH são uma classe de antiretrovirais direccionados para a fase primária da infecção, que guia o reconhecimento, acoplamento e entrada do vírus. Uma vez que inibem o avanço do ciclo viral antes da invasão celular, estes inibidores possuem claras vantagens perante outros antivirais que actuam em estágios tardios. Por não ser necessária a sua presença ao nível do citoplasma, possuem ainda vantagens farmacológicas que favoreceram a aposta no seu desenvolvimento para aplicação terapeutica. Devido à natureza do processo de entrada, a gama de potenciais alvos permite uma variedade de mecanismos inibitórios e espécies moleculares, o que dinamiza as estratégias de combate ao vírus e atrasam o fenómeno de resistência. As proteínas do complexo do envelope (Env), gp41 e gp120, são os mais comuns alvos de inibição. Devido à sua variabilidade conformacional, intimamente relacionada com as propriedades fusogénicas, estas proteínas tornam-se vulneráveis à acção de moléculas que estabilizem umaa estrutura tridimensional específica, competindo na dinâmica de infecção. Anticorpos monoclonais neutralizantes, fragmentos de anticorpo e pequenos péptidos foram já implicados neste tipo de mecanismo inibitório. O envelope viral é também um potencial alvo de inibidores de fusão. O processo de fusão membranar é sensível a variações nas propriedades físicas da bicamada lipídica como a fluidez e a curvatura, que podem ser modificadas pela acção de pequenas moléculas. Considerando que a membrana provém da célula do hospedeiro e não está sujeita a variabilidade genética, é um alvo conservado entre estirpes que não adquire resistência a fármacos. Apesar do interesse demonstrado na última década, suportado por ensaios clínicos promissores, a comercialização e aplicação terapeutica de inibidores de fusão em TARV encontra-se ainda atrasada relativamente a outros inibidores. Apenas um inibidor de fusão, o péptido Enfuvirtide, se encontra actualmente disponível no mercado o que ilustra a necessidade de apostar no melhoramento das propriedades farmacologicas e citotoxicidade. A aplicação de conceitos modernos de biodistribuição, biodisponibilidade aliados a sistemas de libertação controlada recentemente descritos são uma via estratégica no melhoramento da farmacoterapeutica destes inibidores. A versatilidade e diversidade dos inibidores de fusão compatibilizamnos com novas modalidades de direccionamento do fármaco. Independentemente do alvo molecular final, foi já sugerido que a interacção inespecífica com membranas lipídicas desempenha um papel activo no modo de acção de alguns inibidores de entrada Esta interacção gera um aumento de concentração favorável aos mecanismos inibitórios junto dos locais de acção, nomeadamente as membranas viral e da célula hospedeira. De igual forma, se esta interacção for explorada para o desenvolvimento de sistemas lipídicos de transportes de fármacos, as propriedades inibitórias bem como o próprio direccionamento dos inibidores de fusão para os locais de interesse serão consideravelmente aumentados. A possibilidade de promover direccionamento e transporte através do reconhecimento de ambientes membranares poderá ser uma resposta à baixa compatibilidade terapeutica dos inibidores de fusão. Seguindo esta premissa, o principal objectivo deste trabalho foi compreender de que forma diferentes inibidores de fusão, de pesos moleculares e propriedades químicas distintas, poderiam explorar a interacção inespecífica com membranas lipídicas de modo a melhorar o seu direccionamento para os locais de acção e as suas propriedades farmacológicas no geral. Recorremos a três inibidores de fusão: um fragmento de anticorpo, F63; um péptido, sifuvirtide; e uma pequena molécula oxidante, LJ001. Tanto o F63 como o sifuvirtide actuam sobre a proteína gp41, enquanto que o LJ001 inibe a entrada do VIH através da rigidificação do envelope viral. A nossa abordagem consiste em duas frentes com o mesmo princípio base. Por um lado, pretendemos determinar de que forma o fragmento de anticorpo F63 interage com membranas lipídicas que mimetizam a membrana viral (rica em colesterol) e da célula hospedeira (maioritariamente fosfolipídica), tentando correlacionar as observações experimentais com o seu modo de acção. Estudámos também a interacção de duas versões modificadas do F63, F63-MPR e F63-CRAC, nas quais se adicionaram motivos de reconhecimento de colesterol, com os mesmos modelos membranares. Numa outra linha de trabalho, avaliámos a compatibilidade de dois inibidores de fusão, com modo de acção e propriedades moleculares distintas, para o transporte simultâneo na membrana de um sistema de biodistribuição lipossomal catiónico. Através de composições simples com carga e fluidez variável, procurámos identificar a formulação lipídica ideal para uma interacção compatível de ambas as moléculas com a mesma membrana, idealizando um veículo/vector sinérgico não só no modo de acção consertado em diferentes alvos mas também no processo de transporte. Recorremos a técnicas de espectroscopia de fluorescências para analizar a interacção entre os inibidores e as membranas lipídicas. Seguimos a fluorescência intrínseca dos resíduos de triptofano, assim como a fluorescência intrínseca da molécula de LJ001, para traçar o perfil de partição dos três inibidores entre a fase aquosa e lipídica. Com o mesmo intuito, usou-se uma sonda potenciométrica sensível a alterações no potencial dipolar membranar para caracterizar a interacção com modelos membranares. As técnicas de anisotropia e a extinsão de emissão de fluorescência foram também utilizadas para, respectivamente, monitorizar a fluidez membranar e a acessibilidade do fluoróforo à molécula extintora aquando a adsorção/inserção do inibidor no ambiente membranar. O fragmento de anticorpo F63 particiona para membranas lipídicas, independentemente do seu conteúdo em colesterol, o que sugere uma interacção não selectiva com a superfície celular e viral in vivo. As versões modificadas F63-MPR e F63-CRAC não apresentaram aumento de afinidade na presença de colesterol apesar dos domínios de reconhecimento membranar. Pelo contrário, a alteração do F63 parece ter prejudicado ligeiramente a dinâmica de interacção, possivelmente por destabilização da sua estrutura ou pela introdução de um local adicional de ligação à membrana. As nossas observações sugerem que modificações conformacionais poderão explicar a estabilização na superfície membranar, suportadas pela flexibilidade estrutural deste tipo de domínios proteicos. Tanto o sifuvirtide como o LJ001 interagem com lipossomas catiónicos, exibindo preferência para bicamadas em fase ordenada ou fase fluida, respectivamente. Um aumento da carga catiónica traduz-se num aumento da partição do sifuvirtide, que apresenta carga aniónica, mas não parece afectar a partição da molécula de LJ001. Os vectores lipossomais catiónicos de fase ordenada e fluida tiveram sucesso no carregamento das duas moléculas à superfície tanto individual como simultaneamente. Apesar da necessidade de optimização, os resultados são uma prova primária da possibilidade de desenvolver lipossomas como vectores de biodistribuição duais, com modo de acção sinérgico. No entanto, as técnicas de fluorescência foram insuficientes para monitorização eficiente de ambas as moléculas no mesmo plano espacial e temporal, devido à sobreposição das suas propriedades espectrais. Será necessária uma abordagem biofísica de maior complexidade, recorrendo a técnicas capazes de resolver os perfis de interacção individuais, para um mesmo veículo lipossomal.Since its discovery, the Human Immunodeficiency Virus (HIV) has become one of the major concerns of the scientific and medical community. More than 34 million infected people worldwide bear the risk of contracting the Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS), due to limited access to therapy. The available antiretroviral drugs struggle to effectively deplete viral loads and require administration in heavy therapeutic regimens. Fusion inhibitors are a class of antivirals capable of blocking viral progression before cell invasion. Though the initial interest was reinforced by promising clinical results, their therapeutic relevance has fallen in recent years. Still, their versatile molecular properties enable the application of novel concepts of drug targeting and delivery. Following this premise, the aim of our study was to understand how HIV fusion inhibitors of different molecular weight could exploit lipid membrane interactions to enhance their antiviral potency and pharmacological properties. Through a biophysical approach, we analyzed the interaction of the inhibitory single-domain antibody (sdAb) F63 with host and viral model membranes, as well as two modified versions containing cholesterol-targeting domains. We used the same approach to characterize the loading profiles of two fusion inhibitors, sifuvirtide and LJ001, to cationic liposomal membranes, as a primary description of a combined delivery system. F63 has high affinity to lipid model membranes, regardless of cholesterol content, suggesting a potential interaction with both host and viral membranes in vivo. The modified versions of this sdAb failed to enhance the interaction with cholesterol-rich membranes. Sifuvirtide and LJ001 were successfully loaded to cationic membranes, supporting the concept of dual liposomal delivery.Castanho, Miguel Augusto Rico Botas, 1967-Coutinho, Ana Isabel Abrantes, 1965-Repositório da Universidade de LisboaFigueira, Tiago Nascimento2013-12-04T16:49:41Z20132013-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/9621TID:201281848enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:54:09Zoai:repositorio.ul.pt:10451/9621Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:33:46.600372Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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