Deteção e tipificação moleculares de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis em amostras de fezes

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Oliveira, Ana João Azevedo de
Data de Publicação: 2016
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/27317
Resumo: Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016
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spelling Deteção e tipificação moleculares de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis em amostras de fezesParatuberculoseMycobacterium avium subsp. paratuberculosisPCR em tempo realAnálise de MIRU-VNTRAnálise de SNPTeses de mestrado - 2016Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016A paratuberculose ou doença de Johne é uma infeção intestinal granulomatosa crónica, contagiosa e por vezes fatal, causada pela micobactéria patogénica, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map), que afeta predominantemente ruminantes, podendo também infetar outros animais selvagens e domésticos. A paratuberculose é uma doença difícil de detetar e controlar devido à ausência de sinais clínicos, ao longo período de incubação do agente e à falta de métodos fiáveis de diagnóstico nas fases iniciais da doença. O isolamento do agente continua a ser o método de referência para o diagnóstico da paratuberculose. No entanto, é um método moroso devido ao crescimento extremamente fastidioso de Map em meios de cultura artificiais, podendo levar cerca de 6 meses até se obterem colónias visíveis. É, portanto, cada vez mais importante o desenvolvimento e validação de técnicas mais rápidas de modo a identificar os animais excretores e controlar a propagação da infecção. Em Portugal, a paratuberculose encontra-se provavelmente sub-diagnosticada, apenas tendo sido reportado um pequeno número de estudos de prevalência. Com este trabalho, pretendeu-se avaliar a presença de paratuberculose em explorações através do isolamento de Map num total de 106 amostras de fezes: fezes de bovinos, oriundas de explorações dos Açores, com sintomatologia suspeita de paratuberculose (n=72); fezes de bovinos, de explorações de Portugal Continental, sem qualquer tipo de sintoma sugestivo de paratuberculose (n=23); e fezes de caprinos, colhidas em explorações de Bragança, suspeitos de paratuberculose (n=11). As colónias suspeitas, isoladas de 28 amostras de fezes de bovinos, foram identificadas como Map tendo por base a técnica de PCR em tempo real, usando como alvo o fragmento f57, de cópia única. Nas mesmas amostras de fezes, realizou-se ainda, a deteção direta da sequência de inserção IS900, específica de Map e existente em múltiplas cópias no seu genoma, através da técnica molecular de PCR em formato nested em tempo real e avaliou-se a correlação dos resultados pelos dois métodos. Das 106 amostras, apenas 6 amostras de fezes de bovino se mostraram negativas pela técnica de PCR direto na amostra. Dada a morosidade de crescimento destas bactérias no período do estágio, e de modo a ter uma indicação da estrutura populacional dos isolados de Map em Portugal, selecionaram-se 53 DNAs de estirpes de Map isoladas previamente de amostras de fezes da ilha de S. Miguel, Açores e efetuou-se a tipificação molecular por MIRU-VNTR, utilizando oito loci. O estudo do perfil MIRU-VNTR dos isolados, de diferentes freguesias da ilha, revelou que os perfis mais abundantes são o INMV 2 e 3. Os nossos resultados revelam que a maioria dos isolados da ilha pertence à mesma linhagem clonal, o que sugere a existência de uma fonte ambiental comum e a transmissão indireta do microrganismo aos animais que circulam nessa localização geográfica. Por último, testou-se um ensaio baseado na análise de SNPs para a tipificação de 11 estirpes Map isoladas de bovinos. A análise de 14 SNP específicos de Map em 11 isolados da ilha de S. Miguel, Açores, permitiu diferenciar duas variantes genéticas que pertencem à mesma linhagem e possuem um ancestral comum. Quando comparados com a estirpe de referência M. paratuberculosis K10 e, de acordo com a árvore de decisão disponível, estas estirpes aparentam ser do tipo C e pertencem a dois grupos filogenéticos distintos dentro do sub-grupo A: a Clade 4 e a nova Clade 11, descrita anteriormente por Leão e colaboradores [61]. Assim, estes isolados distribuem-se pelos perfis de SNP designados 4 e 11. Esta análise permitiu-nos corroborar a possibilidade de disseminação do microrganismo entre as freguesias. O nosso estudo é um dos primeiros a relatar o isolamento, identificação e tipificação de Map em bovinos portugueses e permite concluir que a paratuberculose está presente nas explorações portuguesas, mesmo em animais assintomáticos, e que a excreção do do microrganismo nas fezes é uma das principais fontes de contaminação. A sua posterior disseminação através de uma fonte ambiental permite perpetuar o ciclo de infeção em outros animais dentro da mesma localização geográfica.Paratuberculosis or Johne's disease is a chronic granulomatous intestinal infection, contagious and fatal, caused by a pathogenic mycobacteria, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map), which predominantly affects ruminants and can also infect other wild and domestic animals. The paratuberculosis is a disease difficult to detect and to control because of the absence of clinical signs, the long period of incubation of the agent and the lack of reliable diagnostic methods at early stages of disease. The isolation of the agent is still the standard method for the diagnosis of paratuberculosis. However, it is a slow method due to the extremely fastidious growth of Map in artificial culture media, and may take about 6 months to obtain visible colonies. It is important to develop and validate more rapid techniques to identify the excretory animals and controlling the spread of infection. In Portugal, paratuberculosis is found probably under-diagnosed, only been reported in a few prevalence studies. This study aims to assess the prevalence of paratuberculosis using the Map isolation a total of 106 fecal samples. Feces from cattle originating from the Azores herd with suspected symptoms of paratuberculosis (n=72) and bovine feces, without any kind of symptom (n=23), of Portugal Continental herd and feces from suspected goats, harvested in Bragança herd (n=11). The suspect colonies isolated from 28 samples of cattle feces were identified as Map based on the real time PCR using target f57 fragment in single copy. It was so performed, in the same fecal samples, direct detection of the insertion sequence IS900, specific for Map that exists in multiple copies in their genome through the molecular technique of PCR nested in real time and evaluated the correlation of results for the two methods. Of the 106 samples, only 6 samples of cattle feces were negative by direct PCR in the sample. Because of the slow growth these cultures have to get an indication of the population structure of Map isolated in Portugal, they selected 53 DNAs from Map isolated from samples of the island of S. Miguel, Azores. After molecular identification, he performed the molecular typing by MIRU-VNTR, using eight loci. For the study MIRU-VNTR profile of isolates from different Island villages, the most abundant profiles are INMV 2 and 3. Our results suggest that the majority of isolates belong to the same island of the clonal lineage, suggesting the existence of an environmental source and the indirect transmission of the microorganism in the geographical location where these animals roam. Finally, we tested a run essay based on the analysis of SNPs for typing of 11 strains isolated from cattle Map. 14 SNP analysis specific Map in 11 isolates of S. Miguel Island, Azores, allowed to discriminate two genetic variants that belong to the same lineage and have a common ancestor. When compared with the strain M. paratuberculosis K10 and according to the decision tree that is available, these strains appear to be type C and belong to two distinct phylogenetic groups within the subgroup A: Clade 4 and the new Clade 11, previously described by Leão and colleagues [61]. Thus, these isolates are distributed by SNP profiles designated 4 and 11. This analysis confirm the possibility of the spread of the microorganism between the villages. Our study is one of the first to report the isolation, identification and characterization of Map in Portuguese cattle and shows that paratuberculosis is present in the Portuguese explorations, even in asymptomatic animals and that the excretion of the microorganism in the stool is one of the main sources of contamination. The subsequent spread throughout an environmental source allows to perpetuate the cycle of infection in other animals within the same geographical location.Botelho, AnaCunha, Mónica VieiraRepositório da Universidade de LisboaOliveira, Ana João Azevedo de2017-03-28T15:16:27Z201620162016-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/27317TID:201623218porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:18:07Zoai:repositorio.ul.pt:10451/27317Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:43:46.252781Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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