Astrocytic CB1R-mediated calcium signalling: impact in glutamate transport and interaction with adenosine receptors

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Ribeiro, Joana Filipa Gonçalves
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/35250
Resumo: Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018
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spelling Astrocytic CB1R-mediated calcium signalling: impact in glutamate transport and interaction with adenosine receptorsAstrócitosCB1RRecetor de adenosinaSinalização de cálcioCaptação de glutamatoTeses de mestrado - 2018Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018Os astrócitos são células multifuncionais que coexistem com os neurónios no sistema nervoso central, cuja morfologia pode variar conforme localização e/ou função. Na sinapse, interagem direta e indiretamente com os terminais pré-sinápticos, pós-sinápticos, e astrócitos vizinhos, uma vez que possuem recetores específicos para neurotransmissores, sendo capazes de libertar gliotransmissores que, por sua vez, se ligam a recetores presentes nos terminais nervosos. Esta comunicação bidirecional entre astrócitos e neurónios leva então ao conceito de sinapse tripartida. Além da gliotransmissão, os astrócitos também são responsáveis pela maioria da captação de glutamato nas sinapses. O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório com um papel crucial na sinalização neuronal. Após ter cumprido a sua função como neurotransmissor, é necessário a saída rápida deste da fenda sináptica de modo a impedir excitotoxicidade. Para tal, astrócitos e neurónios expressam transportadores de glutamato. A atividade destes transportadores é controlada de forma fina por vários componentes intra e extracelulares como fatores de crescimento, neuromoduladores, sinalização de cálcio, etc. Atualmente, cannabis é a droga ilícita mais consumida nos países desenvolvidos. A planta cannabis sativa possui centenas de substâncias psicoativas, como o THC, que se ligam a recetores específicos no cérebro e periferia que, iniciando uma cascada de eventos, levam aos efeitos psicoativos da cannabis, já conhecidos. Hoje em dia sabe-se que os mamíferos são capazes de produzir e degradar endocanabinóides que também se ligam a estes recetores funcionando como neurotransmissores retrógrados. O sistema endocanabinóide passou a ser conhecido por um sistema regulador homeostático com uma sinalização intra e intercelular. Os recetores de canabinóides mais estudados são os recetores de cannabinóides tipo 1 (CB1R) e recetores de cannabinóides tipo 2 (CB2R). O CB1R tem uma expressão mais dominante no sistema nervoso central (SNC) enquanto o recetor CB2 é mais expresso no sistema imunitário. Durante a transmissão sináptica, os terminais pré-sinápticos libertam neurotransmissores na fenda sináptica que, por sua vez, se vão ligar aos recetores expressos nos terminais pós-sinápticos. Uma vez ligados, dependendo do tipo de neurónio/célula, os neurotransmissores podem conduzir a uma variedade de respostas, como inibição, excitação e/ou síntese de segundos mensageiros. Por vezes, os terminais pós-sinápticos respondem ao estímulo através da síntese de endocanabinóides. Estes, por sua vez, são libertados na fenda sináptica ligando-se e ativando os recetores canabinóides. No cérebro, a atividade desses recetores pode afetar múltiplas funções biológicas, como perceção da dor, digestão, aprendizagem, memória, ansiedade e funções cognitivas. Isso é feito através da regulação da transmissão sináptica e da plasticidade, como a inibição da libertação do transmissor, o controlo da excitabilidade neuronal e a regulação da plasticidade sináptica de curto e longo prazo. O CB1R é um recetor acoplado à proteína G (GPCR) do sistema canabinóide com sete domínios transmembranares. A expressão deste não é uniforme ao longo do cérebro, sendo mais expresso no cerebelo, gânglios basais e córtex. Todavia, a baixa expressão do recetor não significa necessariamente que a sua função não é relevante. Nos neurónios, os CB1Rs são geralmente acoplados a Gi/o e, em alguns casos, a Gs, enquanto que nos astrócitos há evidências deste recetor estar acoplado a Gq/11. Nestas células, sabe-se que a ativação deste recetor leva à mobilização de cálcio das reservas intracelulares através da atividade de fosfolipase C (PLC). Semelhante ao CB1R, os recetores de adenosina são um grupo de proteínas GPCR que são ativadas por ligação com a adenosina. Até à data, quatro subtipos de recetores de adenosina foram descobertos e clonados: A1, A2A, A2B e A3. Os recetores A1 e A3 de adenosina são inibitórios sendo acoplados a Gi/o inibindo a acumulação de cAMP e a atividade de proteína quinase A (PKA), enquanto que os receptores A2A e A2B são excitatórios, acoplados a proteínas Gs cuja ativação leva ao aumento de cAMP e ativação de PKA. No SNC, a adenosina é considerada um neuromodulador potente e os recetores A1 e A2A de adenosina estão associados a funções cerebrais críticas, como a libertação e captação de neurotransmissores e plasticidade sináptica. Nos astrócitos, a atividade dos recetores A2A de adenosina está correlacionada com a captação diminuída de aspartato e a regulação da memória, enquanto que os recetores A1 estão correlacionados com a ativação da PLC, sono e fatores de crescimento. O objetivo deste estudo foi entender melhor a sinalização de cálcio mediada pelo CB1R e averiguar a sua relevância na atividade de transportadores de glutamato em astrócitos, assim como estudar a interação entre os recetores de adenosina e o CB1R em astrócitos. Para este fim, foram realizados ensaios de imunocitoquímica, imagiologia de cálcio e captação de glutamato radioativo em culturas primárias de astrócitos. As culturas primárias de astrócitos foram preparadas do córtex cerebral de Sprague Dawley com 0-2 dias, sendo usadas células com 3 semanas em cultura. Nos ensaios de imagiologia de cálcio, foi observada a evolução do cálcio intracelular ao longo do tempo, incubando a cultura de astrócitos com uma sonda FURA-2AM. Nos ensaios de captação de glutamato, foi vista a quantidade de glutamato radioativo incorporada pelos astrócitos. A captação mediada pelo transportador GLAST ou GLT-1 é dada pela diferença entre o transporte total (na ausência de qualquer antagonista) e o transporte obtido quando um destes transportadores é bloqueado. Em imunocitoquímica, a expressão do CB1R, assim como dos principais transportadores de glutamato GLT-1 e GLAST, foi encontrada em culturas primárias de astrócitos. A expressão dos transportadores GLAST e GLT-1 não foi uniforme. O GLT-1 apresentou uma expressão mais alta na área ao redor do núcleo enquanto que o GLAST aparentou ter uma expressão mais alta na membrana e no espaço intracelular. Em imagiologia de cálcio, a presença do agonista seletivo do CB1R induziu transientes de cálcio, sendo que a amplitude e a frequência destes era dependente da concentração de agonista. Na presença de um antagonista seletivo do CB1R, o efeito foi abolido, levando à conclusão que a sinalização de cálcio induzida por ACEA é mediada pela ativação do CB1R. Esta sinalização de cálcio foi abolida na presença de um depletor de reservas de cálcio intracelulares enquanto que, em condição de baixa concentração de cálcio extracelular, a amplitude e frequência diminuíram. Na presença de um antagonista de PLC (U73122), o efeito também foi abolido. Quando a proteína Gi/o foi inibida na presença de um antagonista especifico, PTx, a frequência destes diminuía sem alterações na amplitude, sugerindo fortemente algum tipo de participação por parte de um recetor que não o CB1R acoplado a Gi/o na sinalização de cálcio. Quando o crosstalk entre CB1R e A2AR foi avaliado, observou-se que a pré-ativação de A2AR diminuiu a frequência e a amplitude dos transientes de cálcio mediados por CB1R. Por outro lado, quando o A2AR foi inibido, a frequência de transientes mediada por CB1R aumentou quando comparada à incubação de ACEA isolado. Quando o recetor de adenosina A1 foi previamente inibido, a frequência de transientes induzida pelo CB1R pareceu diminuir. Em ensaios de uptake de glutamato, a presença de ACEA aumentou a captação de glutamato em astrócitos, através de um aumento da constante cinética Vmax na atividade do transportador GLAST sem diferença em Km. Na presença do antagonista do CB1R, este efeito foi abolido, assim como na presença de antagonista de PLC. Já na presença de um antagonista de PKC, uma proteína abaixo na sinalização da via de sinalização de PLC, observou-se uma potenciação do transporte, o que indica que esta proteína é provavelmente não participativa na via. Para saber se a sinalização de cálcio e potenciação do transporte de glutamato mediadas pela ativação do CB1R são efeitos paralelos ou em série, ativou-se o CB1R na presença de um quelante de cálcio. Nesta condição, não se observou potenciação de transporte de glutamato, o que leva a crer que a sinalização de cálcio iniciada pela ativação de CB1R leva à potenciação da atividade do transportador GLAST. Concluindo, em astrócitos, a ativação do CB1R induz transientes de cálcio intracelulares cuja amplitude e frequência têm um comportamento dose-resposta. A ativação de PLC e as reservas de cálcio intracelulares são essenciais para a ocorrência destes transientes. Isto sugere fortemente o acoplamento de Gq/11 ao CB1R, que está de acordo com estudos anteriores. Por sua vez, estes transientes aumentam o transporte de glutamato através do aumento da atividade do transportador GLAST, numa via independente de PKC. A inibição do recetor de adenosina A2A aumenta a sinalização de cálcio mediada pelo CB1R, implicando uma interação direta entre estes dois recetores.Astrocytes are the major glial cell type in the central nervous system (CNS) being responsible for many actions in the CNS. Astrocytes express several types of G-protein coupled receptors, namely the cannabinoid type one receptors (CB1R) that are activated by endocannabinoids released from neurons. Usually these receptors are coupled to Gi/o proteins although there are reports of Gq/11 coupling. In astrocytes, CB1R activation leads to phospholipase C (PLC)-dependent Ca2+ mobilization from internal cellular stores, which will then have key roles in brain function. Astrocytes also express adenosine A2A receptors (A2AR) that, when activated by adenosine, have several modulatory effects, such as the control of glutamate transport. Thus, both type of receptors, CB1R and A2AR, are of pivotal importance in modulation of neuronal excitability. Interaction between CB1R and A2AR have been well studied in neurons, nevertheless nothing is known concerning this crosstalk in astrocytes. From the several roles of astrocytes in the CNS, the glutamate uptake mediated by specific glutamate transporters is one of the most relevant functions, since this function prevents excitotoxicity due to glutamate accumulation in the synaptic cleft. To achieve the suitable glutamate transport from the extracellular space, astrocytes express mainly the glutamate transporters GLAST and GLT-1. Having in mind the lack of information regarding the effect of CB1R in astrocytes, the main aim of this work was to study the role of CB1R activation-mediated calcium signaling upon GLAST transporter in rat primary astrocytic cultures. This study was designed to better understand the role of CB1R activation on astrocytic calcium signalling and to study its relevance upon glutamate transport. Furthermore, this work aimed to study the crosstalk between CB1R and A2AR upon calcium signaling and glutamate uptake. Primary astrocytic cultures from cortex were prepared from Sprague Dawley pups (0-2 days old). Calcium signaling and [3H]-glutamate uptake experiments were performed with 18-23 DIC astrocytes. Calcium signaling experiments were performed using FURA-2AM dye and specific transport mediated by GLAST was achieved by the difference of total glutamate transport and transport in presence of UCPH-101, a specific blocker of this transporter. In primary cultures of astrocytes it was observed that CB1R activation with ACEA led to calcium transients, whose amplitude and frequency was dose-dependent for the two tested ACEA concentrations (0.5 and 1.0 μM). The occurrence of these transients was abolished in the presence of antagonists of CB1R, AM251 (1 μM), of PLC, U73122 (3 μM) and a chelator of intracellular calcium stores, CPA (10 μM). Low extracellular calcium concentration decreased both frequency and amplitude of the transients while inhibition of Gi/o protein, with PTx (5μg/ml), decreased significantly frequency with no significant changes in amplitude. By performing glutamate uptake assays, it was observed that GLAST was the main glutamate transporter in primary astrocytic cultures. CB1R activation increased significantly the Vmax kinetic constant of the GLAST transporter. This potentiation involved PLC and calcium signalling, but was PKC independent. When evaluating the crosstalk between CB1R and A2AR, it was observed that activation of A2AR decreased both frequency and amplitude of CB1R-mediated calcium transients. On the other hand, when the A2AR was inhibited, CB1R-mediated transients frequency was higher when compared to ACEA incubation alone. When adenosine A1 receptor was previously inhibited, the CB1R-elicited transients ‘frequency seemed to be decreased. In conclusion, CB1R activation triggers calcium transients in astrocytes by PLC activation, in a dose-dependent manner. This calcium signaling then enhances glutamate transport probably by increasing the number of functional GLAST transporters in the plasma membrane. In parallel, adenosine A2AR activation decreases CB1R activity. This highly suggests that, in a synapse context, endocannabinoids released by post-synaptic neurons will activate astrocytic CB1Rs, increasing glutamate transport and contributing to clear up excessive glutamate at the synaptic cleft, and that this effect is possibly controlled by adenosine A2A receptors.Vaz, Sandra Cristina Henriques,1978-Farinha, Carlos,1973-Repositório da Universidade de LisboaRibeiro, Joana Filipa Gonçalves2021-10-05T00:30:12Z201820182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/35250TID:202012123enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:31:06Zoai:repositorio.ul.pt:10451/35250Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:49:45.363117Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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