Novel human central nervous system 3D in vitro models: useful tools for evaluation of viral vector-mediated gene delivery
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| Data de Publicação: | 2012 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/8292 |
Resumo: | Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012 |
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Novel human central nervous system 3D in vitro models: useful tools for evaluation of viral vector-mediated gene deliveryBiologia molecularDoenças neurodegenerativasDoença de ParkinsonSistema nervoso centralTeses de mestrado - 2012Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012A prevenção e tratamento de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson, estão ainda longe de se tornarem realidade. Embora as estratégias farmacológicas convencionais se tenham revelado pouco eficazes, resultados preliminares indicam que a terapia génica poderá ter grande potencial. Os vectores adenovirais baseados no serotipo canino 2 (CAV-2) transduzem preferencialmente neurónios em modelos animais, tendo o potencial de ser transportados a longa distância no cérebro via transporte axonal. A expressão epissomal a longo prazo permite uma entrega eficiente do material genético especificamente em neurónios. A aplicação da terapia génica está, no entanto, dependente da resolução de uma série de questões ainda em aberto - em particular, a necessidade de avaliar a sua exequibilidade, eficácia e segurança. O projecto europeu BrainCAV (www.braincav.eu), no qual este plano de trabalhos de mestrado está integrado, propõe-se avaliar o potencial de vectores CAV-2 para gerar modelos celulares geneticamente modificados que permitam estudar os mecanismos moleculares da doença de Parkinson (por introdução de genes com mutações associadas à doença) e como abordagem terapêutica para doenças neurodegenerativas. Tendo em vista a potencial aplicação dos vectores CAV-2 em ensaios clínicos, será necessário, numa primeira fase, avaliar estes efeitos em células humanas de cérebro. Dada a complexidade do sistema nervoso central (SNC), nomeadamente a importância da interacção neurónio-astrócito, é difícil encontrar modelos celulares adequados. Os modelos bi-dimensionais tradicionais de cultura têm-se mostrado ineficazes na recapitulação da fisiologia dos tecidos vivos. Assim, torna-se necessário recorrer a modelos tridimensionais, que apresentem os diferentes tipos celulares do SNC e que recapitulem as interações celulares no contexto tridimensional (3D) em que ocorrem. Visto isto, o principal objectivo deste trabalho era o desenvolvimento de um modelo celular 3D do SNC humano, com aplicação no estudo da doença de Parkinson. Para tal foram utilizadas células percursoras neurais derivadas do mesencéfalo fetal (hmNPCs), que apresentam capacidade de diferenciação nas 3 principais linhagens neurais (neurónios, astrócitos e oligodendrócitos), com forte potencial de diferenciação na linhagem dopaminérgica. Estas células são derivadas da região cerebral que, no adulto, é particularmente afectada com a doença de Parkinson, uma patologia que envolve, entre outros sintomas, a perda progressiva de neurónios dopaminérgicos na zona sub-ventricular do cérebro. Uma metodologia para a geração de neurosferas de hmNPCs diferenciadas tinha sido previamente desenvolvida na unidade de tecnologia de células animais (ITQB-UNL/IBET) [1]. Este processo recorre a sistemas de agitação orbital – erlenmeyers – que são mantidos numa incubadora com atmosfera controlada. Tendo em vista as potenciais aplicações referidas, neste trabalho procedeu-se a uma caracterização detalhada, nomeadamente em termos de fenótipo dopaminérgico e em termos funcionais. A caracterização fenotípica com recurso a técnicas de análise de expressão génica (qRT-PCR) e análise proteica (microscopia de fluorescência e Western blot) revelou que no final do protocolo de diferenciação (uma fase de agregação das células, durante 7 dias, seguida de uma etapa de diferenciação, durante 14 dias) a cultura era composta por uma elevada percentagem de células neuronais. Estas apresentavam marcadores típicos de neurónios maturos (βIII-Tubulin+/MAPS+/Sinaptofisina+, este último num padrão de marcação vesicular, indicativo de vesículas pré-sinápticas). Considerando o objectivo futuro de desenvolver um modelo celular de doença de Parkinson, a diferenciação na linhagem dopaminérgica nesta cultura foi também analisada. No final da diferenciação verificou-se um enriquecimento em neurónios dopaminérgicos nas neurosferas. No entanto, os níveis atingidos mantiveram-se abaixo dos valores obtidos quando estas células são diferenciadas em sistemas bi-dimensionais. A reduzida expressão do factor de transcrição Nurr1, envolvido na manutenção e diferenciação terminal de neurónios dopaminérgicos, sugeriu que as culturas 3D diferenciadas se encontravam num estádio de maturação anterior ao observado nas culturas 2D diferenciadas. Assim, com o objectivo de aumentar a eficiência da diferenciação dopaminérgica, o período de diferenciação foi prolongado; após os 14 dias de diferenciação a cultura foi mantida em condições de maturação (sem morfogéneos), o que permitiu a manutenção de neurosferas diferenciadas em cultura por mais 18 dias, com elevada viabilidade. Adicionalmente foi observado um aumento significativo na expressão de TH, o gene que codifica para a enzima tirosina hidroxilase, da via de produção de dopamina, indicando que a diferenciação dopaminérgica foi favorecida pelas condições de maturação. O terceiro objectivo consistia na integração das etapas de agregação e diferenciação de neurosferas de hmNPC num sistema em biorreactor controlado. Este sistema de cultura tem importantes vantagens em relação à cultura em erlenmeyer, tais como permitir o controlo e monitorização em tempo real dos parâmetros de cultura (pH, pO2 e temperatura), mantendo-os estáveis ao longo da cultura. Para tal, biorreactores de tanque agitado foram inoculados com uma suspensão celular, permitindo um processo de agregação eficiente durante 7 dias. No final deste período, a caracterização fenotípica das neurosferas revelou que permaneciam num estado proliferativo e indiferenciado. Seguiu-se um período de 14 dias de diferenciação e, no final do mesmo, as neurosferas revelaram uma baixa eficiência de diferenciação neuronal. Esta discrepância relativamente ao processo de diferenciação implementado em erlenmeyer poderá resultar nas diferenças entre os dois sistemas, nomeadamente em relação à dinâmica de agitação. Esta está directamente relacionada como a força hidrodinâmica a que as células estão sujeitas, o que pode influenciar a diferenciação das mesmas. Além disto, tanto o pH como também os níveis de pO2 ao longo da cultura poderão contribuir para este resultado, pelo que estudos relativamente aos efeitos dos mesmos terão de ser feitos com vista à optimização da cultura em bioreactor. Assim, a cultura em erlenmeyer foi o sistema escolhido para, numa primeira fase, proceder à avaliação da transdução de neurosferas diferenciadas com vectores CAV-2. Tendo em conta os últimos avanços no campo de engenharia de vectores para terapia génica, a eficiência de transdução e impacto na sobrevivência celular e composição das neurosferas foram avaliados recorrendo a um vector CAV de terceira geração (hd-CAV-2) codificando a proteína repórter eGFP. Estes são vectores CAV-2 aos quais foi retirado a totalidade dos genes virais, o que lhes confere uma maior capacidade de clonagem e uma incapacidade de replicação, propriedades vantajosas em cenários de terapia génica. Por último, e no sentido de desenvolver o potencial deste sistema de cultura como modelo de doença de Parkinson, procedeu-se à transdução de neurosferas diferenciadas com um vector hd-CAV que codificava para uma proteína LRRK2 com a mutação G2019S que foi associada à etiologia da doença). Para tal, foram utilizadas as condições de transdução optimizadas utilizando o vector hd-eGFP. Os resultados revelaram níveis baixos de expressão do transgene nas culturas transduzidas. Isto poderá indicar problemas com a preparação viral, nomeadamente no que respeita ao rácio entre partículas totais e partículas com capacidade infecciosa. No caso desta razão apresentar valores baixos, poderá em parte justificar os elevados níveis de toxicidade observados, assim como os baixos níveis de expressão de transgene. Portanto, testes mais rigorosos à qualidade da preparação viral terão de ser efectuados previamente ao prosseguimento dos estudos; adicionalmente, outros stocks virais serão testados. Em resumo, esta tese contribuiu para o melhoramento do processo de diferenciação de hmNPCs em sistemas de agitação orbital, nomeadamente em termos de duração do tempo de cultura e de maturação neuronal. Foi ainda possível implementar um processo em biorreactores de tanque agitado para a agregação de hmNPCs, ainda que a integração da diferenciação das neurosferas no mesmo sistema necessite ser completamente optimizada. Por último, contribuiu para a caracterização do processo de transdução com recurso a vectores CAV de terceira geração como veículos de manipulação genética, com potencial aplicação tanto em terapia génica como para o desenvolvimento de modelos de doença. Assim, o processo estabelecido nesta tese contribuiu para o desenvolvimento de um modelo celular robusto e reprodutível do SNC, o que poderá contribuir para o aumento da relevância de ensaios pré-clínicos, tanto no desenvolvimento de novos fármacos como na avaliação de vectores de terapia génica.Central Nervous System (CNS) disorders remain a formidable challenge for the development of new and efficient therapies. Gene therapy has emerged as a promising alternative in treating the causes of the disease, instead of merely ameliorating symptoms. For this, hd-CAV vectors have arised as suitable tools, due to the higher safety and lack of immunological memory. Preclinical research of CNS disorders, such as Parkinson’s disease (PD), has traditionally relied on animal models and 2D in vitro cell models, which fail in mimicking in vivo human phenotype. This represents the main obstacle for the translation of CNS drugs into clinical trials. Thus, the main aim of this thesis was the development a human CNS cellular model using human midbrain-derived neural precursor cells (hmNPCs). A protocol for differentiation of hmNPC neurospheres using stirred cultured systems with orbital shaking was already implemented. In this thesis, further characterization showed that the neurospheres were enriched in dopaminergic neurons and were functional, as assessed by detection of synaptic vesicle trafficking using FM1-43 probe. Moreover, this culture system was improved in terms of dopaminergic differentiation. By the end of differentiation, higher values the dopaminergic neuron markers of Nurr1 and TH were detected both at mRNA and proteins levels. Importantly, the improved protocol allowed neurosphere viability for long periods of time by adding a maturation period of 18 days, in which differentiation factors were removed from the culture. Also, a long-term 3D culture system for neural differentiation using controlled stirred-tank bioreactors was implemented, which allowed for aggregation of hmNPCs and is currently under optimization. Furthermore, the potential of third generation canine adenoviral vectors for genetic manipulation of this cellular model was evaluated. This can be of great value as a powerful tool for disease modeling, namely PD through overexpression of Leucine-rich repeat kinase 2 gene (LRRK2) carrying the PD-associated mutation G2019S. Additionally, these hd-CAV vectors could have important applications in gene therapy.Brito, CatarinaSilva, Jorge Miguel Luz Marques da, 1965-Repositório da Universidade de LisboaPinto, Ana Catarina Pereira, 1989-2013-04-15T15:31:48Z20122012-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/8292enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:52:05Zoai:repositorio.ul.pt:10451/8292Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:32:53.075551Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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