A Novel Generation of Lentiviral Vectors for Gene Therapy

• Autor(a) principal: Mestre, Daniel Alexandre Fernandes
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/86620
• topic: Vectores lentivirais; Protease de HIV-1 modificada; Engenharia de glicoproteínas do invólucro; Linhas celulares “empacotadoras”; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Engenharia Química

O uso de vetores lentivirais baseados no Vírus da imunodeficiência humana em ensaios clínicos de terapia génica tem vindo a aumentar devido à sua capacidade de transduzir e modificar permanentemente tanto células não quiescentes como quiescentes, e ao seu padrão de integração considerado mais seguro do que o dos vetores retrovirais. Para tirar partido de todo o potencial destes vetores em terapia génica, são desejáveis linhas celulares produtoras estáveis. Porém, o seu desenvolvimento tem sido dificultado pela citotoxicidade de alguns componentes virais, nomeadamente a protease. Neste trabalho de Mestrado, uma protease geneticamente modificada e menos tóxica foi avaliada para produção de vetores lentivirais. Embora menos citotóxica, esta protease é menos ativa. Enquanto para glicoproteínas do invólucro que não requerem processamento proteolítico – VSV-G – a menor atividade da protease não afetou o título do vetor, a conjugação desta protease com glicoproteínas utilizadas tipicamente no desenvolvimento de células produtoras estáveis – 4070A, GaLV10A1 e RD114A – resultou num título menor. Assim, foi alterado o local de clivagem da protease nestas glicoproteínas por meio de engenharia genética. A modificação dos locais de clivagem da protease no GaLV10A1 permitiu recuperar os títulos virais para níveis semelhantes aos obtidos com a protease wild-type, em produção transiente, com um aumento de 5,5 a 36,7 vezes. As glicoproteínas modificadas estão, de momento, a ser implementadas em linhas celulares produtoras estáveis, que expressam a protease modificada. Este trabalho contribui para o desenvolvimento de uma nova linha celular “empacotadora” estável para a produção contínua de vetores lentivirais, descrevendo primeiramente o uso da protease modificada e fornecendo novas glicoproteínas quiméricas, nomeadamente GaLV10A1giflet. Além disso, esta tese abriu a porta para o uso de uma nova glicoproteína modificada com maior título – GaLV10A1ΔR – para o desenvolvimento de linhas celulares produtoras estáveis recorrendo à estratégia de knock out do recetor celular de GaLV10A1.