The impact of the embryonic molecular clock in early chick embryo elongation

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Fernandes, Ana Cristina Maia
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.1/12203
Resumo: Embryo development is strictly regulated in time and space. One of the mechanisms by which cells have temporal information is the somitogenesis clock. During somitogenesis, somites are formed periodically from the pre-somitic mesoderm (PSM) along the antero-posterior axis. The periodicity of somitogenesis is regulated by an oscillatory gene network that operates within PSM with the same period as somite formation. A member of this network in chick is hairy1, a member of the Hairy and Enhancer of Split (HES) family of transcription factors. The role of Hes proteins in biological contexts is broad, namely in development and more recently in cancer. Previous work from our lab showed that Hairy1 overexpression in PSM precursors in gastrulation stages delays embryo development. To understand this phenotype, we started by evaluating the expression pattern of hairy1 mRNA in gastrulating embryos. hairy is dynamically expressed along the antero-posterior and medial-lateral axes of the primitive streak. To evaluate embryo elongation, we performed live-imaging of embryos cultured in two different techniques: Chapman and New. The embryo elongates continuously over time with an average rate of 159 ± 55 uum/h independently of the culture system. The PSM and segmented region contribute the most for total embryo elongation. To understand the impact of Hairy1 overexpression we electroporated the PSM precursors in gastrulation stages and evaluated embryo elongation over time. The preliminary data obtained suggests that Hairy1 overexpression delays embryo elongation. Our work provides a novel quantitative framework for embryo elongation which can be used for comparative studies of chick embryo development in different conditions. Also, it gives new insights on the role of Hairy1 during embryo development which could be important to better understand development and diseases, such as Cancer.
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spelling The impact of the embryonic molecular clock in early chick embryo elongationEmbrião de galinhaRelógio embrionárioElongamentoImagiologia em tempo realHairy1Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Ciências da SaúdeEmbryo development is strictly regulated in time and space. One of the mechanisms by which cells have temporal information is the somitogenesis clock. During somitogenesis, somites are formed periodically from the pre-somitic mesoderm (PSM) along the antero-posterior axis. The periodicity of somitogenesis is regulated by an oscillatory gene network that operates within PSM with the same period as somite formation. A member of this network in chick is hairy1, a member of the Hairy and Enhancer of Split (HES) family of transcription factors. The role of Hes proteins in biological contexts is broad, namely in development and more recently in cancer. Previous work from our lab showed that Hairy1 overexpression in PSM precursors in gastrulation stages delays embryo development. To understand this phenotype, we started by evaluating the expression pattern of hairy1 mRNA in gastrulating embryos. hairy is dynamically expressed along the antero-posterior and medial-lateral axes of the primitive streak. To evaluate embryo elongation, we performed live-imaging of embryos cultured in two different techniques: Chapman and New. The embryo elongates continuously over time with an average rate of 159 ± 55 uum/h independently of the culture system. The PSM and segmented region contribute the most for total embryo elongation. To understand the impact of Hairy1 overexpression we electroporated the PSM precursors in gastrulation stages and evaluated embryo elongation over time. The preliminary data obtained suggests that Hairy1 overexpression delays embryo elongation. Our work provides a novel quantitative framework for embryo elongation which can be used for comparative studies of chick embryo development in different conditions. Also, it gives new insights on the role of Hairy1 during embryo development which could be important to better understand development and diseases, such as Cancer.O desenvolvimento embrionário é um processo altamente regulado no tempo e espaço no qual uma única célula dá origem a um organismo completamente funcional e organizado. Todos os processos que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário têm de desenrolar-se numa determinada ordem e no tempo e espaço corretos. Um dos principais eventos durante os primeiros estadios do desenvolvimento é a gastrulação (Gilbert, 2014). A gastrulação é um processo complexo e extremamente importante que envolve vários eventos, como a transição epitelial-mesenquimal, migração de células, entre outros (Gilbert, 2014). Este acontecimento é crucial dado que é nesta fase que se formam as três camadas germinativas: a mesoderme, a endoderme, a ectoderme. As três camadas germinativas irão mais tarde dar origem a toda a variedade de células e tecidos que povoam o organismo e que são necessárias para uma correta morfogénese (Gilbert, 2014). Nos estadios que antecedem a gastrulação, o embrião é composto por duas camadas de células: o epiblasto e o hipoblasto. As duas camadas têm diferentes funções sendo que as células do epiblasto irão dar origem às diferentes camadas embrionárias e o hipoblasto contribui para os tecidos extraembrionários e é importante para a sinalização molecular que regula a migração das células do epiblasto (Gilbert, 2014). À medida que a gastrulação ocorre no embrião, este alonga ao longo do eixo ântero-posterior. Os processos que regulam a elongação do embrião ainda não são totalmente compreendidos, no entanto assentam em reorganização de células dentro de tecidos, migração de células e divisão celular (revisto em Benazeraf and Pourquie, 2013). Após o inicio da gastrulação, e à medida que o embrião elonga, inicia-se a formação dos sómitos a partir da mesoderme pré-somítica (MPS) num evento chamado de somitogénese. Os sómitos são estruturas transientes que mais tarde se diferenciam em vertebras, músculo, entre outros tecidos. A somitogénese não só é a primeira evidência de segmentação do eixo ântero-posterior dos vertebrados mas também é um processo periódico e como tal é altamente regulado tanto no tempo como no espaço (revisto em Bailey, 2015). A primeira evidência experimental de como as células num embrião são capazes de “contar” tempo foi descoberta no contexto deste processo (Palmeirim et al., 1997). Palmeirim e os seus colaboradores mostraram que o mRNA de hairy1, oscillava na MPS com o mesmo periodo da formação dos sómitos na galinha. Hairy1 faz assim parte do relógio, sendo que este é um componente do modelo mais aceite atualmente para explicar o processo de somitogénese: o modelo do relógio e frente de diferenciação (“clock and wavefront”). Este modelo divide-se em dois componentes: a frente de diferenciação que dá informação espacial às células e é composta por gradientes opostos de sinalização FGF/Wnt e de ácido retinóico; o relógio que dá informação temporal às células, que é composto por uma rede regulatória de genes que são expressos de forma cíclica com o mesmo período da formação dos sómitos na MPS (revisto em Bailey, 2015). Um dos membros deste relógio no embrião de galinha é Hairy1 (Palmeirim et al., 1997). Hairy1 pertence à família dos Hairy-enhancer-of-split (Hes) conhecidos por serem repressores de transcrição (revisto em Kageyama et al., 2007). Os Hes têm importantes funções durante o desenvolvimento embrionário regulando vários processos celulares, nomeadamente a diferenciação celular (reviewed in Kageyama et al., 2007). Hes1, homólogo humano de hairy1, foi também associado a vários processos no desenvolvimento e progressão do Cancro, nomeadamente a metástases e resistência a drogas (revisto em Liu et al., 2005). Alguns membros da família Hes apresentam expressão oscilatórias nas células. Os tempos de meia-vida curtos tanto do mRNA como da proteína e a sua regulação via ciclos de feedback negativo, permitem-lhes manter a expressão oscilatória ao longo do tempo (revisto em Uriu, 2016). A expressão dinâmica de genes e de proteínas tem importantes funções na determinação de respostas biológicas diferenciais, existindo assim uma correlação entre dinâmica de expressão/atividade e resposta celular. A dinâmica da expressão de Hes tem um papel crucial nas respostas diferenciais das células a estímulos e em diferentes processos do desenvolvimento, como por exemplo na neurogénese, onde expressão oscilatória de Hes1 leva a proliferação celular de células estaminais neurais enquanto que a expressão a níveis constantes leva à diferenciação das mesma células em astrócitos (revisto em Kageyama 200). Dado que a oscilação dos genes Hes é importante para as respostas celulares, alteração na dinâmica de expressão destes genes pode ter um impacto no desenvolvimento embrionário. Trabalhos previamente realizados no laboratório mostraram que quando Hairy1 é sobre-expresso em células precursoras da MPS durante estádios de gastrulação, o tronco do embrião fica atrasado no desenvolvimento relativamente à cabeça. O fenótipo é visível morfologicamente mas também com recurso a marcadores moleculares, sendo que o fenótipo observado é transiente (Andrade et al., em revisão). A forma como Hairy1 tem um impacto no desenvolvimento e como o embrião recupera são ainda desconhecidos. Algumas das hipóteses que poderão explicar o impacto da sobre-expressão de Hairy1 no desenvolvimento são: 1) Hairy1 afeta a divisão celular; 2) Hairy1 afeta a migração das células; 3) Hairy1 afeta a diferenciação das células. De forma a tentar perceber o fenótipo descrito começou-se por caracterizar a expressão do mRNA de hairy1 em embriões em estadios de gastrulação por in hibridação in situ. Observou-se que hairy1 é dinâmicamente expresso ao longo dos eixos antero-posterior e medio-lateral da linha primitiva. Não foi possível avaliar a expressão proteica apesar de várias optmizações. De forma a compreender a elongação do embrião de galinha foi avaliado por imagiologia em tempo real, a taxa de elongação do embrião e de diferentes tecidos cultivados em dois sistemas de cultura diferentes: Chapman (Chapman et al., 2001) e New (New, 1959). Foi possível mostrar que o elongamento de embriões em estadios iniciais é independente do sistema de cultura usado. Observou-se que o embrião alonga continuamente ao longo do tempo com uma taxa de 159 ± 55 IUUUUm/h e que os estadios HH5/6 apresentam as taxas mais altas. A MPS e a zona segmentada são as porções que contribuem mais para a alongamento total do embrião. Para compreender o impacto da sobreexpressão de Hairy1 no desenvolvimento do embrião sobreexpressou-se Hairy1 nos precursores da MPS em estadios de gastrulação (HH4) e avaliou-se o alongamento dos embriões. Apesar do reduzido número de réplicas biológicas, os dados sugerem que a sobreexpressão de Hairy1 nos precursores da PSM atrasa o alongamento do embrião. Obtiveram-se resultados preliminares da aplicação de light-sheet microscopy mostrando que poderá ser usada no futuro para avaliar a divisão e migração de células em embriões de galinha. Assim, no decurso deste trabalho obteve-se uma análise quantitativa de comprimentos ao longo do tempo do embrião e diferentes porções do mesmo. Esta análise constitui uma ferramenta muito útil no estudo do desenvolvimento de embriões de galinha e em diferentes condições experimentais. Durante o projeto mostrámos ainda que a sobrexpressão de Hairy1 em precursores da PSM provoca um atraso na alongamento do embrião. Compreender o papel de Hairy1 no desenvolvimento pode fornecer importantes dados para a compreensão do impacto dos seus homólogos, como Hes1, no Cancro.Andrade, Raquel P.Palmeirim, IsabelSapientiaFernandes, Ana Cristina Maia2019-02-16T01:30:12Z2018-02-162018-02-16T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.1/12203TID:202024318enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-24T10:24:09Zoai:sapientia.ualg.pt:10400.1/12203Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T20:03:34.689533Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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