Pathophysiology of Niemann-Pick disease type C: Study of the potential interaction between NPC1, PMCA2 and ABCC3 proteins

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Perdigão, Sofia Alexandra Pardal
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/43474
Resumo: Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019
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spelling Pathophysiology of Niemann-Pick disease type C: Study of the potential interaction between NPC1, PMCA2 and ABCC3 proteinsNPCPMCA2ABCC3LípidosMestrado Integrado - 2019Ciências da SaúdeTrabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019A doença Niemann-Pick tipo C (NPC) é uma doença rara, um distúrbio letal, autossómico recessivo e com uma deficiência no armazenamento lisossomal, caracterizada por apresentar uma complexa neurodegeneração e morte prematura, normalmente durante a infância. Os genes que causam este distúrbio são os genes NPC1, responsáveis por 95% dos casos e NPC2, apenas responsáveis por 5% dos casos. Estes estão envolvidos no transporte intracelular de lípidos e colesterol. No caso dos lípidos (colesterol, esfingomielina, glicolípidos e fosfolípidos), estes vão acumular-se no lisossoma e endossoma tardio do baço, fígado e sistema nervoso, como resultado de um transporte deficiente dentro das células respetivas. A existência de mutações em qualquer um destes genes leva a uma acumulação progressiva do colesterol não esterificado e de outros lípidos já referidos, no sistema nervoso central e em órgãos periféricos. Na NPC, a proporção de nascimentos é 1:100 000 em França, Reino Unido e Alemanha, mas, no entanto, este número pode ser uma estimação abaixo do valor real, uma vez que é consideravelmente difícil estabelecer um número fidedigno. A razão pela qual acontece, é devido à inexistência de uma triagem óbvia no que diz respeito a esta doença, e, portanto, é provável que seja mais comum do que este número sugere. No entanto, foi previamente estudado que todas as etnias são afetadas do mesmo modo e não existe um fator diferencial entre elas. A idade de diagnóstico na NPC é altamente variável e as suas primeiras manifestações podem ser hepáticas, neurológicas ou até psiquiátricas. Estas podem ser detetadas no período perinatal, com problemas a nível hepático em 50% dos casos. Na infância e adolescência, os sinais iniciais da doença podem incluir hepatoesplenomegália, ataxia e dificuldades no que diz respeito à aprendizagem geral dos doentes com NPC. Relativamente às manifestações na idade adulta, estas podem incluir demência, ataxia cerebral e disartria (caracterizada pela dificuldade em articular as palavras de um modo correto e percetível). Como tal, ao existir um deficiente transporte intracelular de lípidos (incluindo a esfingosina) é possível que o consequente armazenamento de esfingosina possa interferir na função do transporte de cálcio (Ca2+) e por isso, é muito provável que possa ocorrer na NPC, uma diminuição da atividade nas bombas de Ca2+. Baixos níveis de Ca2+ levam a uma acumulação de colesterol, esfingomielina e glicoesfingolípidos e por isso é relevante falar acerca de uma das famílias transportadoras de Ca2+, PMCA. A função principal desta família transportadora é exportar Ca2+ do citoplasma para o exterior das células e regular a homeostasia do Ca2+. É importante realçar que neste estudo, esta família vai terá um papel fundamental no decorrer do projeto. Para além desta família transportadora, a família ABC, família cassete de ligação ao ATP, é caracterizada por utilizar a energia de ligação e hidrólise do ATP para transportar substâncias através da membrana, e por isso, será também objeto de estudo neste projeto, com fundamental destaque, a sub-família ABCC3. Neste modelo, propomos que o NPC1 é um sensor de colesterol que regula o conteúdo de colesterol e de lípidos no lisossoma, promovendo a captação de cálcio e o efluxo de esfingosina, a partir do lisossoma. Este estudo propõe um modelo em que o NPC1, na presença de colesterol, se liga diretamente a um transportador de cálcio, ativando-o, e este, por sua vez, se liga a um transportador de esfingosina, o PMCA2, sendo ativado também. Estudos previamente realizados em levedura, de Colaço et al. (dados não publicados de Platt lab) demonstraram que Ncr1 (ortólogo de NPC1) se liga diretamente com PMC1, um ortólogo de PMCA2. Também foi estudado que PMC1 se liga diretamente a YCF1, uma proteína associada à resistência a múltiplas drogas, ortólogo de ABCC3, um membro da família de transportadores ATP binding cassette (ABC). Para além disso, resultados obtidos previamente por ensaios de complementação biomolecular (BiFC) indicaram que NPC1 e PMCA2 interagem diretamente num sistema de mamíferos (dados não publicados de Fernandez-Suarez). O objetivo deste estudo é confirmar a interação entre NPC1 e PMCA2, usando uma técnica diferente e avaliar a ligação entre PMCA2 e ABCC3, com a utilização de BiFC. Neste estudo, conseguimos confirmar a interação direta entre NPC1 e PMCA2 por co-imunoprecipitação, mas, por outro lado, embora tenhamos clonado com sucesso os plasmídeos necessários para realizar o BiFC, não conseguimos detetar nenhuma interação entre PMCA2 e ABCC3. Podemos afirmar que serão necessários mais estudos para avaliar esta interação, assim como a formação de um heterocomplexo que contenha as proteínas NPC1, PMCA2 e ABCC3, de modo a que seja possível regular o transporte de lípidos.Niemann-Pick disease type C (NPC) is a lethal, autosomal recessive, lysosomal storage disorder characterized by neurodegeneration and premature death, usually in childhood. The causative genes NPC1 (about 95% of cases) and NPC2 (about 5% of cases) are involved in the intracellular trafficking pathway of lipids. Mutations on either of these genes lead to progressive accumulation of unesterified cholesterol and other lipids in the central nervous system and peripheral organs. We hypothesise that NPC1 is a cholesterol sensor that regulates cholesterol and glycosphingolipid content in the lysosome by the promotion of calcium uptake and sphingosine efflux from the lysosome. This study proposes a model in which NPC1, in the presence of cholesterol, directly binds and activates a calcium transporter and this one binds and activates a sphingosine transporter. Preliminary studies in yeast from Colaço et al. (Platt lab unpublished data) demonstrated that Ncr1 (NPC1 orthologue) directly binds PMC1, a calcium ATPase orthologue of the human plasma membrane calcium ATPase 2 (PMCA2). She also found that PMC1 binds directly to YCF1, a multidrug resistance associated protein, orthologue of the human ABCC3, a member of the ATP binding cassette (ABC) family of transporters. Moreover, previous results obtained by bimolecular complementation assay (BiFC) indicated that NPC1 and PMCA2 directly interact in a mammalian system (Fernandez-Suarez, unpublished data). The purpose of this study is to confirm the interaction between NPC1 and PMCA2 using a different technique and to assess PMCA2-ABCC3 interaction, by BiFC. In this study, we were able to confirm the direct interaction between NPC1 and PMCA2 by co-immunoprecipitation. Also, although we successfully cloned the plasmids necessary to perform the BiFC, we were unable to detect any interaction between PMCA2 and ABCC3. Further studies will be needed to evaluate this interaction as well as the formation of an heterocomplex containing NPC1, PMCA2 and ABCC3 proteins for the regulation of lipids transport.Laboratório Platt, OxfordSuarez, Maria FernandezRocha, João Pedro FidalgoRepositório da Universidade de LisboaPerdigão, Sofia Alexandra Pardal2022-12-20T01:30:31Z2019-12-202019-11-112019-12-20T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/43474TID:202475948enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:43:59Zoai:repositorio.ul.pt:10451/43474Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:56:16.535534Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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