Evaluation of the antifungal activity of chitin binding lectins from Mauritia flexuosa and Artocarpus incisa in Candida albicans, Cryptococcus neoformans and Aspergillus fumigatus

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Cavalcante, Yuri Costa Barreto
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/34270
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017
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spelling Evaluation of the antifungal activity of chitin binding lectins from Mauritia flexuosa and Artocarpus incisa in Candida albicans, Cryptococcus neoformans and Aspergillus fumigatusCiências BiofarmacêuticasTeses de mestrado - 2017Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017Fungos são seres eucarióticos, protistas, não fotossintéticos, sua estrutura celular tem grande similaridade com as células humanas, diferenciando se apenas por conter quitina (que é um polímero de cadeia longa de N-acetilglucosamina) em sua parede celular, esta similaridade dificulta a ação de medicamentos anti fúngicos convencionais pois estes não são tão seletivos, o que pode causar efeitos adversos e resistência do patógeno aos medicamentos. Normalmente indivíduos saudáveis conseguem resistir a infecções fúngicas, porém em grupos de pacientes com sistema imune prejudicado por medicamentos anticancerosos ou portadores de condições específicas como AIDS ficam sujeitos a infecções fúngicas oportunistas principalmente por Cryptococcus neoformans, Candida albicans e Aspergillus fumigatus. Uma alternativa terapêutica seria buscar novos compostos de preferência com baixo custo e alvo molecular mais seletivo para células fúngicas com menor citotoxicidade em células humanas, como por exemplo, as lectinas que são proteínas de origem não imunológica encontradas em microorganismos, animais e mais frequentemente em vegetais, que são capazes de se ligar reversivelmente e seletivamente à hidratos de carbono específicos sem alterar sua estrutura. Estas proteínas são de grande interesse científico devido às outras propriedades imunológicas (ativa sistema complemento fagocitando patógenos), farmacológicas (medicamentos de liberação prolongada, biomarcadores); antitumoral (reconhece hidratos de carbono específicos de células neoplásicas); anti-HIV1 (inibe proteases e transcriptase reversa) e antimicrobianas (aglutina fungos e bactérias), o que as torna uma importante ferramenta biotecnológica na identificação de receptores de membrana e estudos citoquímicos e farmacológicos. As lectinas podem ser classificadas de acordo com sua estrutura e evolução (quitina-ligantes contendo domínios de heveína, inativadoras de ribossomos, manose-ligantes de monocotiledôneas e lectinas relacionadas à jacalina) ou classificadas pela especificidade de ligação a hidratos de carbono específicos (ligantes de manose, glicose, maltose, N-acetilglicosamina) e finalmente classificadas de acordo com sua estrutura global (Merolectinas que se liga a apenas um hidrato de carbono, Hololectinas que possuem dois ou mais sítios ligantes a hidratos de carbono idênticos, Quimerolectinas que possuem pelo menos um sítio ligante a hidratos de carbono e outro sítio com outra atividade biológica, Superlectinas que possuem dois ou mais domínios ligantes a hidratos de carbono mas diferentes das hololectinas reconhecem hidratos de carbono com estruturas diferente e as Multilectinas que possuem dois ou mais domínios ligantes a hidratos de carbono, idênticos, mas que podem se ligar a açúcares diferentes. A purificação de lectinas é feita principalmente através de cromatografia de afinidade, onde o extrato bruto a conter lectinas passa através de uma matriz com o hidrato de carbono que a lectina em estudo tem afinidade, e as outras moléculas sem afinidade passam sem se ligar, enquanto que as moléculas específicas para o extrato, no caso hidratos de carbono , são retidas e a proteína desejada é obtida com alto grau de pureza e seletividade, posteriormente será libertada da coluna e dialisada, obtendo se um extrato proteico puro e concentrado. Artocarpus incisa possui lectinas muito semelhantes às lectinas de Artocarpus integrifólia, que já são bem caracterizadas, descobriu-se uma lectina inédita em A.incisa chamada de Frutaquina que interagiu com a matriz de quitina em cromatografia de afinidade e apresenta similaridade estrutural com Jaquina que é uma lectina ligante de quitina de A.integrifolia, o que estimulou avaliar sua purificação, rendimento e actividade anti fúngica. As monocotiledôneas como Mauritia flexuosa L.f. são pouco estudadas e carecem de mais estudos de investigação de suas lectinas, normalmente possuem lectinas termoestáveis o que garante a estabilidade de sua atividade biológica e também possuem bom rendimento de extração, estudos anteriores demonstraram que o extracto proteico de M. flexuosa interagiu com a matriz de quitina, comprovando que ela pode ser uma possível fonte de lectinas quitina ligante. Mauritia flexuosa L. f. e Artocarpus incisa são plantas que possuem lectinas que se ligam seletivamente a quitina presente na parede celular de fungos e podem servir como alternativa terapêutica para combater fungos patogênicos oportunistas, então o objetivo deste trabalho é obter um extracto proteico puro e concentrado destas lectinas e avaliar principalmente sua atividade antifúngica em três fungos patogênicos oportunistas que são Cryptococcus neoformans, Candida albicans e Aspergillus fumigatus. Para purificação das lectinas de M. flexuosa utilizou-se o tampão Citrato Fosfato 0,1M pH 6,5 com NaCl 0,15M. O extrato foi submetido a fracionamento com Sulfato de Amônio 60% (F60) e foi utilizado na cromatografia de afinidade em Quitina equilibrada com Tampão Citrato Fosfato 0,01M pH 6,5 com NaCl 0,15M e depois dialisado exaustivamente com água de osmose overnight. O Extrato proteico foi então submetido a ensaios de Termoestabilidade, Aglutinação em Saccharomyces cerevisiae, e ensaios anti fúngicos. Na purificação da lectina ligante de quitina de A.incisa chamada Frutaquina, o extrato bruto foi submetido a purificação de outras lectinas presentes na amostra para posteriormente isolar a lectina ligante de quitina, então primeiro ele foi aplicado em coluna de galactomanana para reter lectinas D-galactose ligantes (Frutalina), depois a fração não ligada anteriormente foi aplicada em coluna de sepharose-D-manose para retirar as lectinas D-manose ligantes (Frutapina) e a fração não ligada foi aplicada em coluna de quitina equilibrada com tampão PBS e eluída onde se obteu o extrato proteico de Frutaquina pura. Como o rendimento de purificação da Frutaquina foi baixo (3 mg) só foi possível realizar a Eletroforese e o ensaio de aglutinação em Saccharomyces cerevisiae, não sendo possível realizar os ensaios anti fúngicos, pois iria demandar muito tempo, visto que seu processo de purificação é bastante demorado e complexo e a estabilidade do extrato proteico poderia ser comprometida. Frutaquina foi capaz de aglutinar Saccharomyces cerevisiae na concentração de 1mg/mL e a sua Eletroforese mostrou que ela possui perfil eletroforético muito similar a Jaquina, que é outra lectina ligante de quitina que possui similaridade aminoacídica de 98% com Frutaquina, desta forma é possível que ambas estas lectinas possuam atividades semelhantes. As lectinas de M. flexuosa possuem um rendimento bem mais satisfatório do que as de A.incisa, onde 50g de sementes de M. flexuosa se obteu 30 mg de proteína pura, apresentou alta resistência a variação de temperatura, onde mesmo após ser autoclavada a 100 °C por 20 minutos ainda manteve sua actividade de ligar-se seletivamente a matriz de quitina e aglutinar S. cerevisiae. Nos ensaios anti fúngicos, as lectinas quitina ligantes de M. flexuosa foram capazes de aglutinar Cryptococcus neoformans e Candida albicans na concentração de 5 mg/mL e associado à Fluconazol 5 mg/mL de Fluconazol + 5 mg/mL de extrato proteico com lectinas), porém não foi capaz de inibir o crescimento de Aspergillus fumigatus. Portanto, as lectinas ligantes de quitina são uma alternativa terapêutica promissora para investigação e desenvolvimento de novos biofármacos com alvo molecular mais seletivo e menor possibilidade de efeitos colaterais. A Frutaquina purificada de A.incisa possui rendimento muito baixo, porém exibe potencial anti fúngico, sugere-se a possibilidade de estudos de investigação para utilizar a tecnologia do DNA recombinante para produção de proteínas recombinantes em grande escala. As lectinas purificadas de M. flexuosa são uma opção mais acessível e de baixo custo, com bom rendimento, grande resistência a altas temperaturas e potencial anti fúngico satisfatório, além de não aglutinar eritrócitos humanos, desta forma, provavelmente apresenta segurança para ser incorporada em formas farmacêuticas de uso tópico ou oral. Estudos posteriores são necessários para comprovar a segurança destas lectinas e avaliar qual a melhor forma farmacêutica para incorporação além de outras possíveis atividades biológicas, para produção de novos fármacos de uso oral pode-se aplicar nanopartículas de galactomananas e xiloglucanas para medicamentos de liberação controlada para garantir melhora da farmacocinética e farmacodinâmica e para desenvolvimento de pomadas pode se aplicar géis à base de hemiceluloses vegetais contendo lectinas D-galactose ligantes para modulação do processo cicatricial e melhora das lesões causadas pelos fungos associada ao poder aglutinante das lectinas ligantes de quitina.Moreira, Ana Cristina de Oliveira MonteiroSilva, Olga Maria DuarteRepositório da Universidade de LisboaCavalcante, Yuri Costa Barreto2018-07-20T11:49:27Z2017-07-272017-06-082017-07-27T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/34270TID:201742675enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:29:32Zoai:repositorio.ul.pt:10451/34270Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:49:02.419910Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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