Interaction between occluding junctions and planar cell polarity during epithelial wound healing

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Rodrigues, Patrícia Alexandra Rosa Porfírio Rodrigues
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/47815
Resumo: Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, 2020
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spelling Interaction between occluding junctions and planar cell polarity during epithelial wound healingReparação de feridasPolaridade planarJunções de oclusãoVia Ft-DsEpitélioTeses de mestrado - 2020Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências BiológicasTese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, Faculdade de Ciências, Universidade de Lisboa, 2020Os tecidos epiteliais consistem num conjunto de células polarizadas ligadas entre si por junções celulares. Estes tecidos atuam como barreira protetora primária que deve ser reparada de imediato quando danificada de modo a prevenir infeções por parte de organismos patogénicos e a desidratação do tecido ou órgão. Em epitélios simples, como é o caso do epitélio do intestino ou epitélios embrionários, este processo de reparação inicia-se com a polarização do citoesqueleto nas células adjacentes à ferida, levando à formação de um cabo contráctil, composto por filamentos de actina e miosina, que se acumula em redor da ferida e que rapidamente une as células promovendo o fecho da lesão. Posteriormente, as células adjacentes à ferida entram num processo de migração celular ao mudarem de forma e se reorganizarem entre elas. Pensa-se que estes movimentos celulares sejam controlados, não só pela dinâmica do citoesqueleto, mas também pelas proteínas de junção que regulam a adesão celular e transmitem sinais mecânicos entre células. Estas proteínas de junção incluem as junções de adesão e as junções de oclusão (OJs). Por fim, assim que a ferida está selada, estas junções celulares e a polaridade das células necessita de se restabelecer para recuperar a estrutura normal e funcionalidade do tecido. As OJs controlam o transporte paracelular de moléculas ao longo do epitélio, ao estabelecer uma barreira entre as zonas apical e basal das células epiteliais, mais conhecida por barreira de permeabilidade. São ainda essenciais para estabelecer a polaridade apical-basal uma vez que separam a membrana apical e baso-lateral de uma célula epitelial. Estudos recentes têm sugerido que as OJs também podem desempenhar um papel na mecânica do tecido epitelial independentemente das suas funções de barreira. Por exemplo, foi demonstrado que as OJs influenciam a forma das células e são necessárias para uma reorganização celular adequada durante o fecho da ferida. No entanto, os mecanismos moleculares pelos quais esta influência ocorre ainda não são conhecidos. A polaridade numa célula epitelial é crucial para manter a arquitetura do tecido e as suas funções. A polaridade apical-basal é determinante para o desenvolvimento e função de tecidos e órgãos, como por exemplo, o transporte de fluidos e a direção da secreção. Para além desta polaridade, existe uma outra polaridade que se estabelece ao longo do plano do tecido, localizada perpendicularmente ao eixo apical-basal, conhecida por polaridade planar (PCP). A PCP é responsável por regular vários processos celulares ao nível do tecido, como é o caso de divisões celulares, regulação da forma das células e direção da migração celular. Para além disso, a PCP também regula a formação de estruturas planares polarizadas, como por exemplo, os pelos que cobrem o corpo dos insetos e mamíferos e que apontam todos para o lado posterior do animal ou os estereocílios que cobrem o ouvido interno em mamíferos. A PCP é regulada por duas vias de sinalização evolutivamente conservadas: a via “core” e a via “Fat-Dachsous (Ft-Ds)”. Para estabelecer esta polaridade é necessário que haja uma segregação assimétrica das proteínas que a constituem. Para propagar a polaridade, estas proteínas estabelecem pontes entre si em células epiteliais adjacentes. No caso da via “core”, as proteínas Frizzled, Disheveled e Diego ficam de um lado da célula epitelial, Van Gogh e Prickle do outro e a proteína Flamingo estabelece a conexão entre Frizzled e Van Gogh entre células epiteliais adjacentes. Na via Ft-Ds, Ds localizado na zona anterior de uma célula interage com Ft localizado na zona posterior da célula adjacente. Por fim, a informação desta polaridade precisa de ser traduzida ao nível molecular e celular para eventualmente dar origem a estruturas ou a eventos celulares polarizados, como por exemplo a orientação de um pêlo ou a direção da migração celular. Contudo, os mecanismos moleculares que atuam a jusante de Ft e Ds ainda não estão caracterizados. O papel da PCP durante o processo de fecho da ferida no epitélio foi pouco explorado até ao momento. Dado que as OJs também estão envolvidas na regulação da forma das células e nos rearranjos celulares e como consequência provocam defeitos no fecho da ferida, surgiu a hipótese de que as OJs poderiam influenciar o estabelecimento da PCP. Assim, esta tese pretende investigar se as OJs interagem com as vias da PCP e se essa interação é necessária para promover o fecho da ferida no tecido epitelial. Neste estudo, foi usada a Drosophila melanogaster (vulgo mosca-da-fruta) como modelo de estudo. Este modelo possuí vantagens significativas em comparação com outros modelos animais, nomeadamente, ser fácil e barata de manter e manipular tanto fisicamente como geneticamente e ter um ciclo de vida de apenas dez dias. Este ciclo apresenta diferentes estádios (embrião, três estádios de larva, pupa e fase adulta) cada um com as suas próprias vantagens. O estádio escolhido para desenvolver esta tese foi o embrionário uma vez que, para além de estar bem estabelecido no nosso laboratório, é um modelo bastante adequado à aquisição de imagens em tempo real. Adicionalmente, a dinâmica das células epiteliais no fecho da ferida no epitélio do embrião é muito semelhante ao que acontece em vertebrados. Para além disso, por ser constituído por células grandes e facilmente visualizadas em imagens de tempo real, o embrião constitui um modelo ideal para estudar os mecanismos celulares e moleculares associados à PCP. Com o intuito de analisar o papel da PCP no fecho da ferida, optou-se primeiramente por fazer um screen genético baseado em feridas induzidas por laser. Este screen revelou que a via Ft-Ds é essencial para este processo, ao contrário do que é observado para a via “core”. Deste modo, prosseguiu-se o estudo com a análise da via Ft-Ds. Assim, o primeiro objetivo desta tese foi perceber a possível interação entre esta via e as OJs. Os nossos dados demonstram que a perda de função da proteína Kune, pertencente às OJs, leva a uma alteração na localização apical das proteínas Ft e Ds nas células epiteliais antes da ferida e a uma alteração na localização de Ds no bordo de uma ferida. Por outro lado, a perda de função da proteína Ft não causa qualquer alteração na localização da proteína Coracle, também pertencente às OJs. Estes resultados sugerem-nos que as OJs podem influenciar a função da via Ft-Ds ao destabilizar a sua localização, mas que o contrário não é observado. A próxima abordagem seria tentar perceber quais os mecanismos moleculares que levam a estas alterações. O segundo objetivo deste estudo foi perceber de que modo a via Ft-Ds participa no processo de fecho da ferida. Para tal, o processo de fecho da ferida foi observado ao longo do tempo, em tempo real e através de microscopia confocal, em embriões com mutações para as proteínas Ft e Ds, de modo a acompanhar todo o processo e dinâmica de fecho da ferida. Os nossos resultados sugerem que a proteína Ft não desempenha um papel essencial neste processo. Por outro lado, foi demonstrado que embriões mutantes para a proteína Ds apresentam defeitos no fecho da ferida caracterizados por uma diminuição nos níveis de filamentos de actina, um aumento na área celular, antes e durante o fecho da ferida, e uma diminuição dos rearranjos celulares. Este é um fenótipo semelhante ao descrito anteriormente para mutantes para a proteína Kune. Desta forma, os nossos resultados apresentam a primeira evidência de um papel essencial da via Ft-Ds no fecho de feridas epiteliais. Em suma, aqui propomos que as OJs regulam o fecho da ferida no tecido epitelial ao controlar a localização das proteínas da via Ft-Ds, que por si são necessárias para modular as formas e reorganização celular. Este estudo acrescenta assim um novo elemento essencial ao processo de fecho da ferida e poderá ser bastante importante para perceber os mecanismos deste processo em sistemas de maior complexidade.Epithelial tissues act as primary protective layers that must be promptly repaired when damaged. In simple epithelia, this process initiates with cytoskeleton polarization in the cells adjacent to the wound, leading to the formation of a contractile actomyosin cable at the wound edge that quickly pulls the cells together to seal the gap. Besides having a role in the transport of molecules across the epithelium, it has been demonstrated that Occluding Junctions (OJs) also influence cell shapes and are required for proper cellular rearrangements during wound closure. Planar cell polarity (PCP) is the polarity along the plane of the tissue placed perpendicular to the apicobasal polarity axis. PCP is responsible for regulating many cellular processes at the tissue level, such as orienting cell divisions, regulating cell shapes and directing cell migration. However, its role in epithelial wound healing is still poorly explored. Given that OJs also regulate cell shapes and cellular rearrangements, we hypothesized that these junctions may interact with PCP to promote epithelial wound healing. In this thesis, we used the Drosophila melanogaster embryonic epidermis as a model system to understand if PCP interacts with OJs and if PCP plays a role in wound healing as described previously for OJs. PCP is regulated by two main conserved signalling pathways: the “core” and the “Fat-Dachsous (Ft-Ds)” pathways. Our data suggests that the Ft-Ds pathway, but not the core pathway, is essential for wound healing. Our results show that OJ loss-of-function leads to an altered subcellular localization of both Ft and Ds proteins, suggesting that OJs may influence the function of the Ft-Ds PCP pathway. In addition, we demonstrate that ds mutants present a wound closure phenotype characterized by decreased F-actin levels and defects in cell area and cellular rearrangements, as previously described for OJ mutants. Together, our data present the first evidence of an essential role of the Ft-Ds PCP pathway in wound healing. In summary, we propose that OJs regulate epithelial wound closure by controlling the subcellular localization of the Ft-Ds PCP pathway proteins, which in turn are required for proper cellular shapes and rearrangements. Importantly, in this study, an additional player in wound closure is introduced which could be essential to understand how this process is regulated in more complex systems.Carvalho, Lara Cristina de JesusReis, Ana Maria GonçalvesRepositório da Universidade de LisboaRodrigues, Patrícia Alexandra Rosa Porfírio Rodrigues2023-12-31T01:31:17Z202020202020-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/47815TID:202695689enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-01-01T01:16:21Zoai:repositorio.ul.pt:10451/47815Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:59:47.468533Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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