Desenvolvimento de processos integrados para produção e purificação de fragmentos de anticorpos usando sistemas aquosos bifásicos

• Autor(a) principal: Correia, Andreia Sofia Gomes
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10773/33257
• topic: Fragmentos de ligação ao antigénio; Processo integrado; Digestão proteolítica; Sistemas aquosos bifásicos termorreversíveis; Líquidos iónicos

Os anticorpos monoclonais (mAbs) e, em particular, os seus fragmentos de ligação ao antigénio (Fabs) são agentes terapêuticos importantes no tratamento de diversas patologias. Em comparação com os mAbs intactos, os Fabs têm emergido como alternativas promissoras devido a possuírem uma maior eficiência terapêutica. Os Fabs possuem dimensões reduzidas e estruturas mais simples, as quais contribuem para a redução de ligações inespecíficas devido à ausência do fragmento cristalizável (Fc), maior especificidade, menor imunogenicidade e maior capacidade para penetrar nos tecidos. A produção dos Fabs (processamento a montante) encontra-se bem estabelecida e recorre à digestão enzimática dos mAbs intactos ou através da fermentação microbiana por Escherichia coli recombinante. Contudo, a sua purificação (processamento a jusante) não está padronizada e é usualmente responsável pelos elevados custos de produção. O processamento a jusante de Fabs recorre a múltiplas técnicas cromatográficas, nomeadamente utilizando ligandos de afinidade dispendiosos e envolvendo procedimentos morosos e complexos. Numa tentativa de ultrapassar os obstáculos descritos, o objetivo desta dissertação passa por desenvolver plataformas integradas de produção e purificação de Fabs recorrendo a sistemas aquosos bifásicos (SABs) termorreversíveis. Utilizando os polímeros polietileno glicol com peso molecular de 3350 g/mol (PEG 3350) e o dextrano com peso molecular de 450.000-650.000 g/mol (Dex 500 K) como formadores de fase, foram determinados os diagramas de fases dos SABs a 25, 37 e 45ºC e na ausência e presença de líquidos iónicos (LIs) como adjuvantes. A capacidade de formação de SABs decresceu com o aumento da temperatura, enquanto o uso de LIs como adjuvantes favoreceu o aumento da região imiscível. O processo integrado desenvolveu-se por aplicação de um estímulo de temperatura aos SABs, nos quais a digestão proteolítica de IgG (produção de Fabs) ocorreu à temperatura ótima de ação da enzima (37ºC região monofásica) e a purificação de Fabs decorreu a 25ºC (região bifásica). Inicialmente, o método de digestão proteolítica com papaína foi validado e a partição dos fragmentos de anticorpos nos SABs foi estudada recorrendo a eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Posteriormente, procedeu-se à integração das duas etapas através da execução da digestão proteolítica na presença dos componentes dos SABs. Após diminuição da temperatura de 37 para 25ºC, foi possível verificar a formação de um sistema bifásico e avaliar o desempenho dos SABs na purificação de Fabs. Em termos de seletividade da etapa de purificação de Fabs, os SABs constituídos por PEG 3350 a 15% (m/m) e Dex 500 K a 15% (m/m) contendo 10% (m/m) dos LIs brometo de tri-(n-butil)[4-etoxi-4-oxobutil]amónio ([Bu3NC4]Br) e brometo de colínio ([Ch]Br) revelaram-se os mais promissores de entre os sistemas testados. Embora sejam necessários mais estudos de otimização das condições do processo e dos métodos de quantificação dos fragmentos de anticorpos, espera-se que este processo possa vir a contribuir para diminuir o custo de produção de Fabs e torná-los uma opção terapêutica mais acessível a toda a população.