The role of MEG3 lncRNA in imprinting and pluripotency

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Godinho, Inês Filipa Banha
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/35561
Resumo: Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018
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spelling The role of MEG3 lncRNA in imprinting and pluripotencyEpigenéticaMetilação do DNAGenomic ImprintingPluripotêncialncRNA MEG3Teses de mestrado - 2018Mestrado em Biologia Molecular e GenéticaTese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018Desde que se descobriu que as células estaminais embrionárias, descritas como autorrenováveis e pluripotentes, podiam ser obtidas a partir de embriões pré-implantados e expandidas indefinidamente in vitro, muito se especulou sobre as suas possíveis utilizações na medicina regenerativa e na criação de modelos celulares de doenças. Contudo, apesar destas esperanças iniciais, as considerações éticas relativas ao uso de embriões humanos e o risco de imuno-rejeição após transplante inviabilizaram a sua posterior aplicação. A solução para ultrapassar estas limitações parecia ser a criação de células pluripotentes oriundas de células somáticas do próprio paciente, através de um processo de reprogramação celular. Neste sentido, em 2006, foram descritas as primeiras células estaminais pluripotentes induzidas, conhecidas na sigla inglesa por iPSCs, que, por serem semelhantes às células estaminais embrionárias na morfologia e nas capacidades de pluripotência, vieram renovar as expectativas nas suas promissoras aplicações. O processo de reprogramação, no qual é baseado a formação de iPSCs, implica a superação da barreira epigenética das células diferenciadas. Por este motivo, e apesar dos vários avanços na tecnologia da reprogramação, este continua a ser um processo pouco eficiente e propenso a erros epigenéticos, tendo um impacto relevante em fenómenos epigenéticos como é o caso do “genomic imprinting”. O “genomic imprinting” é um processo que ocorre em alguns domínios genómicos e que resulta na expressão génica de apenas um dos alelos parentais. O alelo expresso é determinado com base na diferença de marcas epigenéticas, nomeadamente ao nível da metilação do DNA, entre ambos os alelos. Erros no “imprinting” ocorrem frequentemente durante a reprogramação das iPSCs e têm um impacto negativo na sua capacidade de pluripotência. Contudo, é essencial que o estado de “imprinting” da célula dadora seja preservado ao longo da reprogramação para que a sua utilização futura seja segura. Isto é especialmente importante quando se geram iPSCs derivadas de pacientes com doenças associadas ao “genomic imprinting”, onde é fundamental que o estado de “imprinting” seja mantido, para que estas células possam ser utilizadas na criação de modelos celulares das doenças. Um dos domínios sujeito a “imprinting” descrito como sendo um dos mais suscetíveis a este tipo de erros é o DLK1-DIO3. O domínio DLK1-DIO3 encontra-se localizado no cromossoma 14 humano e no cromossoma 12 murino. Este domínio contém três genes codificantes, DLK1, RTL1 e DIO3, expressos a partir do alelo paterno e vários genes não codificantes expressos a partir do alelo materno, incluindo os RNA não codificantes longos (lncRNA) MEG3, RTL1-antisense (RTL1-AS) e MEG8, assim como RNAs não codificantes pequenos, snoRNAs e microRNAs. O principal elemento envolvido na regulação do “imprinting” é a IG-DMR, que consiste numa região intergénica diferencialmente metilada (DMR) entre os dois alelos, encontrando-se metilada no alelo paterno e desmetilada no alelo materno. Para além da IG-DMR, outras DMRs estão descritas neste domínio, como por exemplo a MEG3-DMR, localizada na zona do promotor do lncRNA MEG3. A desregulação do “imprinting” neste locus causa duas síndromes em humanos, conhecidas como síndrome de Temple (associada à perda de expressão de genes codificantes paternos e sobre-expressão dos RNA não codificantes maternos), e síndrome de Kagami-Ogata (associado à perda de expressão dos genes não codificantes maternos e sobre-expressão dos genes paternos) caracterizados por múltiplos problemas de desenvolvimento físico e intelectual. A desregulação do “imprinting” é também muito frequente em iPSCs, onde o alelo materno tem tendência em adquirir hipermetilação, o que conduz à perda de expressão do lncRNA MEG3 e dos outros RNAs não codificantes. Consequentemente, estas iPSCs têm menores capacidades de pluripotência e diferenciam menos eficientemente em determinados tipos celulares. A contribuição de cada gene desregulado nestas iPSCs, incluindo o silenciamento do lncRNA MEG3, para este fenótipo é desconhecido. Tal como ocorre noutros domínios “imprinted”, acredita-se que também neste seja um dos seus lncRNAs o responsável pela regulação do “imprinting”. O candidato principal é o MEG3 e vários estudos anteriores, onde se realizou “Knockouts” para este gene, apontam para esta possibilidade. Contudo, estas abordagens não permitem garantir que seja efetivamente a molécula de lncRNA do MEG3 a responsável, pois os “Knockouts” causam a eliminação da sequência do DNA do gene MEG3 (incluindo também sequências adjacentes), e, portanto, a atribuição do impacto somente ao lncRNA transcrito por esta região não é correta. Desta forma, o principal objetivo desta dissertação é averiguar o papel deste lncRNA na regulação do ”imprinting” deste domínio e na pluripotência através da modulação dos níveis de expressão deste RNA. Como ponto de partida para o estudo da regulação do “imprinting”, utilizámos iPSCs isogénicas que apresentavam diferentes padrões de metilação no IG-DMR: uma linha iPSC com IG-DMR normal (alelo paterno metilado e alelo materno desmetilado), e outra linha iPSC com IG-DMR hipermetilado (ambos os alelos parentais metilados). Assim, começámos por avaliar o impacto da hipermetilação do IG-DMR no estado de metilação do MEG3-DMR, tal como na expressão do próprio MEG3 e de outros RNAs não codificantes como o lncRNA MEG8. Observámos que a hipermetilação do IG-DMR resultou na hipermetilação do MEG3-DMR, e que nestes casos não havia, como esperado, expressão do lncRNA MEG3, nem do lncRNA MEG8. De seguida, quisemos perceber como estas alterações afetavam o “imprinting” do DLK1, ou seja, se este se tornaria bialélico na linha iPSC com IG-DMR hipermetilado e sem expressão do MEG3. Como esperado, verificou-se que esta linha iPSC apresentava expressão bialélica do DLK1. Contudo, ao contrário da nossa previsão, observámos que a linha iPSC com padrão de metilação normal, exibia também expressão bialélica do DLK1. Enquanto esta investigação decorria, um estudo recentemente publicado sobre células estaminais embrionárias de ratinho permitiu-nos entender este resultado inesperado. Nesse estudo foi descrito que células no estádio estaminal expressavam bialelicamente um nível muito baixo de Dlk1, e que apenas durante a diferenciação neuronal é que os níveis de expressão do Dlk1 aumentavam no alelo paterno, sendo que no alelo materno os níveis se mantinham sempre muito baixos através de um mecanismo de regulação que possivelmente envolve o lncRNA Meg3. Neste sentido, o passo seguinte foi induzir a diferenciação neuronal nas iPSCs para avaliar se ocorria o aumento da expressão do DLK1 e, se na ausência do MEG3, a expressão se tornava bialélica. Observámos que efetivamente, havia um pico de expressão muito significativo no dia 17 da diferenciação e que na linha celular hipermetilada e sem expressão do MEG3, a expressão era claramente bialélica, enquanto que na linha celular com padrão e expressão de MEG3 normais, os resultados indicaram, preferencialmente, uma tendência para a expressão do alelo paterno. Pensamos que esta tendência apenas não foi traduzida numa expressão claramente monoalélica, devido ao facto de dentro do conjunto de células analisadas a maioria ter uma expressão monoalélica do DLK1, enquanto que a minoria restante pudesse ter expressão bialélica devida a uma incorreção do estado de metilação do IG-DMR. A nossa análise na linha iPSC com IG-DMR hipermetilado e sem expressão do MEG3 é coerente com a possibilidade do lncRNA MEG3 ter um papel fulcral na regulação do “imprinting” e, como consequência, na pluripotência das iPSCs. Para entendermos especificamente o papel desempenhado pelo lncRNA MEG3 no “imprinting”, decidimos silenciar a expressão deste lncRNA. Para tal, utilizámos “Antisense Locked Nucleic Acids (LNA) GapmeRs”, que demonstrámos serem uma ferramenta bastante eficiente no silenciamento da expressão do MEG3 em iPSCs indiferenciadas. Verificámos que a par do silenciamento do lncRNA MEG3, também o lncRNA MEG8 foi silenciado, o que contribuí para a ideia de que ambos fazem parte da mesma unidade de transcrição policistrónica. Em seguida, decidimos realizar a experiência do silenciamento do MEG3 no dia 17 da diferenciação neuronal na linha iPSC com preponderância de expressão do DLK1 a partir do alelo paterno. O propósito desta experiência foi entender se o silenciamento do lncRNA MEG3 revertia a expressão maioritariamente paterna em expressão bialélica, onde ambos os alelos parentais se expressassem de forma equitativa. Infelizmente, esta experiência não funcionou por motivos técnicos, muito provavelmente, devido à natureza e densidade celulares durante este estádio de diferenciação. Por essa razão, decidimos então proceder ao silenciamento do MEG3 em fibroblastos, as únicas células estudadas sobre as quais sabíamos que o DLK1 era exclusivamente expresso pelo cromossoma paterno. Nesta experiência, o silenciamento do MEG3 foi muito eficaz (<5% da expressão normal) e levou a uma reativação modesta do alelo materno do DLK1. Este resultado sugere a participação de RNAs não codificantes como o MEG3 ou mesmo o MEG8, também silenciado nesta experiência, na regulação do “imprinting” deste gene. Em suma, com este trabalho foi possível testar pela primeira vez o impacto real do lncRNA MEG3 na regulação do “imprinting” do domínio DLK1-DIO3. Os resultados aqui apresentados, sugerem que o MEG3 e/ou outros RNAs não codificantes expressos no alelo materno, como, por exemplo, o MEG8, podem ter um papel importante na regulação do “imprinting” em todo o domínio. No futuro, será interessante investigar através da abordagem de silenciamento com LNAs GapmeRs contra o MEG3 ou até mesmo contra o MEG8, o impacto noutras linhas celulares com níveis mais abundantes de expressão monoalélica do DLK1. Também será importante estudar os mecanismos de atuação destes e de outros lncRNAs, de modo a garantir a manutenção correta do “imprinting” neste locus.In 2006, Takahashi and Yamanaka demonstrated that it was possible to convert a differentiated cell into an induced pluripotent stem cell (iPSC) with self-renewing and pluripotent capabilities and enormous biomedical potential. However somatic reprogramming into iPSCs is still inefficient and prone to epigenetic errors which impact on phenomena such as genomic imprinting. Genomic imprinting is a process that occurs in some genomic domains and results in a monoallelic expression of genes depending on their parental origin. This is determined by a differential epigenetic marking, by DNA methylation of the two parental alleles. DLK1-DIO3 domain represents an example of a genomic region regulated by genomic imprinting. This domain contains several protein-coding genes, such as DLK1, expressed from the paternal allele and several non-coding genes from the maternal homolog, including the long non-coding RNAs (lncRNA) MEG3 and MEG8. The main regulatory element involved in imprinting is an intergenic methylated region (IG-DMR), that is methylated in the paternal allele and unmethylated in the maternal one. In addition, other DMRs are described in this domain, such as MEG3-DMR, believed to be hierarchically dependent on IG-DMR. Deregulation of imprinting at this locus causes two human syndromes known as Temple and Kagami-Ogata syndromes. Deregulation of imprinting is also very common in iPSCs, where the maternal allele tends to acquire hypermethylation which leads to loss of non-coding RNAs expression, including MEG3. Consequently, these iPSCs have lower pluripotency potential. The contribution of each deregulated gene, including silencing of the MEG3 lncRNA to this phenotype in iPSCs is unknown. It is believed that one of the lncRNAs is responsible for the imprinting regulation in this domain. MEG3 is the main candidate based on the results from several MEG3 KO studies. However, these approaches did not ensure that the MEG3 lncRNA molecule is indeed the responsible. Thus, the main objective of this dissertation is to investigate the role of this lncRNA in the imprinting regulation of this domain and pluripotency by modulating its expression levels. We initially used isogenic iPSCs with different methylation patterns at IG-DMR: an iPSC line with normal IG-DMR and another iPSC line with hypermethylated IG-DMR to understand the mechanisms of imprinting regulation of this locus in iPSCs. Hypermethylation of IG-DMR resulted in the hypermethylation of MEG3-DMR, and consequently to the lack of lncRNA MEG3 expression. As expected, we also detected that the hypermethylated line had biallelic DLK1expression. Interestingly, the iPSC line with normal IG-DMR also exhibit low, but biallelic DLK1 expression, a finding corroborated by others in mouse embryonic stem cells. We then induce neuronal differentiation in the iPSCs and observed a very significant peak of DLK1 expression at day 17 of differentiation with a bias towards the paternal allele in normal iPSCs, but clearly biallelic in iPSC with hypermethylated IG-DMR and no MEG3 expression. We felt this time point provide a good system to enquire about the role of MEG3 on DLK1 imprinting during differentiation of iPSCs. To specifically understand the role played by MEG3 lncRNA, we downregulate its expression using Antisense Locked Nucleic Acids (LNA) GapmeRs. This approach proved to efficiently downregulate MEG3 in undifferentiated iPSCs. Interestingly, LNAs against MEG3 also downregulate MEG8 lncRNA contributing to the idea that both are part of the same unit of polycistronic transcription. Unfortunately, MEG3 LNAs did not work at day 17 of neuronal differentiation for unforeseen reasons. We then decide to downregulate MEG3 in fibroblasts, the only cells presenting exclusive paternal DLK1 expression. In this experiment, effective MEG3 downregulation led to a modest re-activation of the maternal DLK1 allele. This result suggests the participation of non-coding RNAs such as MEG3 or even MEG8, also silenced in this experiment, in the regulation of DLK1 imprinting. In summary, with this work it was possible to test for the first time the real impact of the MEG3 lncRNA on the regulation of the imprinting of the DLK1-DIO3 domain. In the future, it will beinteresting to investigate the impact of MEG3 or even MEG8 on other cell lines with more abundant levels of monoallelic expression of DLK1 through silencing with LNAs GapmeRs. It will also be necessary to understand from the mechanistic point of view how these lncRNAs act to ensure the correct maintenance of imprinting at this locus.Rocha, Simão José Teixeira daRodrigues, Maria Gabriela, 1965-Repositório da Universidade de LisboaGodinho, Inês Filipa Banha2018-12-03T12:10:52Z201820182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/35561TID:202012115enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:31:42Zoai:repositorio.ul.pt:10451/35561Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:50:02.301359Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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