Functional analysis of RTX proteins of Sinorhizobium meliloti and role in biological nitrogen fixation symbiosis

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Matos, Sílvia Filipa Lopes de, 1987-
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/10824
Resumo: Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
id RCAP_e3e36f4961b0e4b15e81e9ad06cc243a
oai_identifier_str oai:repositorio.ul.pt:10451/10824
network_acronym_str RCAP
network_name_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository_id_str 7160
spelling Functional analysis of RTX proteins of Sinorhizobium meliloti and role in biological nitrogen fixation symbiosisSimbioseFixação de nitrogénioPlantas leguminosasTeses de mestrado - 2013Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013Sinorhizobium meliloti é uma bactéria fixadora de azoto que estabelece simbiose com plantas leguminosas do género Medicago. No decorrer da simbiose, ocorre uma troca de sinais entre a planta e a bactéria, levando à formação de nódulos nas raízes. Este processo tem como objetivo a fixação biológica de azoto surgindo, do ponto de vista agrícola, como uma alternativa ao uso de fertilizantes industriais. O genoma de S. meliloti codifica para inúmeras proteínas RTX, caracterizadas pela presença de sequências nonapeptídicas repetitivas ricas em resíduos de glicina e aspartato, que irão favorecer a ligação ao ião cálcio. Algumas destas proteínas estão implicadas no processo simbiótico mediando a biossíntese e/ou modificação de exopolissacáridos. Muitas ainda estão por caracterizar, apesar de algumas delas apresentarem um fenótipo simbiótico, como é o caso de SMc04171, SMb20079 e SMb20838. Uma mutação no gene SMc04171 origina um menor número de nódulos, enquanto mutações em SMb20079 e SMb20838 parecem afectar a colonização dos mesmos. Tendo estas informações em mente, o objetivo deste trabalho foi caracterizar estas três proteínas. Delineou-se inicialmente uma estratégia para construção de mutantes de eliminação em cada um dos genes, o que constituiria uma vantagem face aos de inserção por serem mais estáveis. Não obstante uma série de passos de clonagem bem sucedidos, nenhum dos mutantes de eliminação chegou a ser obtido. Usaram-se então mutantes de inserção disponíveis para os ensaios conjuntos da estirpe selvagem e mutante de modo a avaliar se uma possível redução de competitividade poderia ser a responsável pelo fenótipo simbiótico anteriormente identificado. Para isso, inocularam-se as raízes de Medicago sativa com os diferentes mutantes e estirpe selvagem nas proporções 10:90, 50:50 e 90:10. Após contagem das unidades formadoras de colónias presentes nos nódulos com 5 semanas de desenvolvimento, os níveis de competição foram semelhantes entre mutantes, independentemente da proporção testada. No caso do mutante SMc04171, a média do número de nódulos foi maior em condições de dominância da estirpe selvagem, resultado que está de acordo com os obtidos previamente. Em estudos anteriores, os nódulos de plantas inoculadas com os mutantes para SMb20079 e SMb20838 não apresentavam células viáveis. Contudo, neste trabalho verificaram-se proporções idênticas de células da estirpe selvagem e mutantes no inóculo inicial e colonização final, o que pode ser explicado pelo fornecimento da proteína RTX extracelular por parte da estirpe selvagem, compensado assim a deficiência imposta pelos mutantes. Para caracterizar a atividade bioquímica das proteínas em estudo, os genes SMb20079 e SMb20838 foram clonados no vetor pWH844. Esta clonagem originou uma cauda His-tag na região N-terminal. Verificou-se que todas as proteínas recombinantes são sobre-expressas em Escherichia coli, ainda que só His-SMb20079 tenha sido purificada até à homogeneidade por cromatografia de afinidade. A migração em SDS-PAGE destas proteínas aconteceu para valores cerca de duas vezes superiores ao seu peso molecular, comportamento característico de algumas proteínas acídicas. Na tentativa de identificar uma possível função destas proteínas, foram pesquisadas as homologias com outras proteínas RTX e foram construídos os modelos das estruturas tridimensionais de cada proteína. Apesar das ferramentas bioinformáticas apontarem para um possível papel na proteólise, na modificação de hidratos de carbono e até mesmo na adesão celular, a função destas proteínas ainda tem de ser determinada.Sinorhizobium meliloti is a nitrogen fixing bacterium establishing symbiosis with leguminous plants of the genus Medicago. During symbiosis, an intense signal exchange between bacteria and the infected plant occurs, leading to the formation of root nodules. Biological nitrogen fixation takes place in these new organs, emerging as an alternative to the use of industrial fertilizers. S. meliloti has one of the highest numbers of repeats in toxin (RTX) proteins, characterized by having aspartate and glycine-rich nonapeptide repeats involved in Ca2+-binding. Some of these RTX proteins have been implicated in symbiosis by mediating exopolysaccharide biosynthesis and/or modification. Others, despite having a symbiotic phenotype, remain uncharacterized. Such is the case of SMc04171 whose mutation gives rise to fewer nodules, and of SMb20079 and SMb20838 which seem to have a role during nodule colonization. The aim of this work was the functional characterization of these three proteins. The first attempt was the construction of deletion mutants by gene replacement with an interposon cassette. Despite many successful cloning steps, no deletion mutant in any gene was achieved. Since there were insertion mutants available, their co-inoculation with the wild-type strain in ratios 10:90, 50:50 and 90:10 was performed in Medicago sativa roots. Data showed similar competitiveness for each mutant when compared with the wild-type. This can be explained by the fact that these RTX proteins are extracellular and therefore its secretion by the wild-type strain may complement mutant’s deficiency in co-inoculation experiments. The three proteins under study were expressed in E. coli as fusions to a his-tag and protein His-SMb20079 was successfully purified to homogeneity. Despite bioinformatics tools predict that SMb20079, SMb200838 and SMc04171 proteins may have a role in proteolysis, carbohydrate modification or even cell adhesion, the function of these proteins still needs to be determined.Moreira, Leonilde M.Santos, Mário de Almeida, 1955-Repositório da Universidade de LisboaMatos, Sílvia Filipa Lopes de, 1987-2014-04-07T14:28:06Z20132013-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/10824TID:201327449enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T15:56:38Zoai:repositorio.ul.pt:10451/10824Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:34:43.963505Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
dc.title.none.fl_str_mv Functional analysis of RTX proteins of Sinorhizobium meliloti and role in biological nitrogen fixation symbiosis
title Functional analysis of RTX proteins of Sinorhizobium meliloti and role in biological nitrogen fixation symbiosis
spellingShingle Functional analysis of RTX proteins of Sinorhizobium meliloti and role in biological nitrogen fixation symbiosis
Matos, Sílvia Filipa Lopes de, 1987-
Simbiose
Fixação de nitrogénio
Plantas leguminosas
Teses de mestrado - 2013
title_short Functional analysis of RTX proteins of Sinorhizobium meliloti and role in biological nitrogen fixation symbiosis
title_full Functional analysis of RTX proteins of Sinorhizobium meliloti and role in biological nitrogen fixation symbiosis
title_fullStr Functional analysis of RTX proteins of Sinorhizobium meliloti and role in biological nitrogen fixation symbiosis
title_full_unstemmed Functional analysis of RTX proteins of Sinorhizobium meliloti and role in biological nitrogen fixation symbiosis
title_sort Functional analysis of RTX proteins of Sinorhizobium meliloti and role in biological nitrogen fixation symbiosis
author Matos, Sílvia Filipa Lopes de, 1987-
author_facet Matos, Sílvia Filipa Lopes de, 1987-
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Moreira, Leonilde M.
Santos, Mário de Almeida, 1955-
Repositório da Universidade de Lisboa
dc.contributor.author.fl_str_mv Matos, Sílvia Filipa Lopes de, 1987-
dc.subject.por.fl_str_mv Simbiose
Fixação de nitrogénio
Plantas leguminosas
Teses de mestrado - 2013
topic Simbiose
Fixação de nitrogénio
Plantas leguminosas
Teses de mestrado - 2013
description Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
publishDate 2013
dc.date.none.fl_str_mv 2013
2013-01-01T00:00:00Z
2014-04-07T14:28:06Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv http://hdl.handle.net/10451/10824
TID:201327449
url http://hdl.handle.net/10451/10824
identifier_str_mv TID:201327449
dc.language.iso.fl_str_mv eng
language eng
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron:RCAAP
instname_str Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron_str RCAAP
institution RCAAP
reponame_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
collection Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository.name.fl_str_mv Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
repository.mail.fl_str_mv
_version_ 1799134242817441792

Registros relacionados