Instability of X-chromosome inactivation in female human iPSCs

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Esteves, Cristiano Emanuel Ribeiro
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/51829
Resumo: Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2021
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spelling Instability of X-chromosome inactivation in female human iPSCsCélulas estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs)Inativação do cromossoma X (XCI)Modelo pré-clínicoX-inactive specific transcript (XIST)Domínio/Área Científica::Ciências MédicasTrabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2021As células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) constituem um poderoso sistema celular que pode ser usado como modelo pré-clínico ou como terapia celular em medicina regenerativa. No entanto, as iPSCs possuem uma heterogeneidade epigenética considerável que pode ser ilustrada ao nível do estado de inativação do cromossoma X (XCI) em iPSCs femininas. Após a reprogramação de células somáticas, a maioria possui um cromossoma X ativo e outro inativo (Xi), como é normal em todas as células femininas. Contudo, com a passagem em cultura há a perda de expressão do RNA não codificante XIST, o principal regulador da XCI, sendo este o primeiro sinal da reativação parcial do Xi – processo conhecido como erosão do Xi. O estado variável da XCI pode comprometer o seu uso como modelo pré-clínico de doenças ligadas ao X que afetam o sexo feminino. Nesta tese, estudou-se o impacto do estado da XCI num grupo de iPSCs femininas. Primeiro, identificou-se, por RT-qPCR, iPSCs que expressam (XIST+) ou não XIST (XIST-), uma linha celular estaminal embrionária XIST- e uma linha iPSC com expressão intermédia de XIST. Posteriormente, foi caracterizado a reativação de vários genes ligados ao X, recorrendo a RNA FISH para transcritos nascentes e a RT-PCR seguido de sequenciação de Sanger para genes com variantes genéticas. Os resultados evidenciaram variabilidade no padrão de XCI entre as iPSCs femininas. Para além da existência de iPSCs XIST+ e XIST-, foram detetadas diferenças no grau de reativação entre as iPSCs XIST-. Na ausência da expressão de XIST, identificaram-se três grupos de genes: (1)genes inertes à reativação; (2)genes sempre reativados; (3)genes reativados em apenas algumas linhas iPSCs XIST-. Estes resultados são importantes para a definição dos critérios de qualidade de iPSCs femininas como modelo de doenças ligadas ao X, revelando-se fulcral a avaliação do estado de inativação do gene causador da doença.Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a powerful cellular system for disease modelling and regenerative medicine. However, iPSCs still have considerable epigenetic heterogeneity which impacts on epigenetic phenomena such as X-chromosome inactivation (XCI) in female iPSCs. Upon reprogramming from somatic cells, most female iPSCs have one active and one inactive X-chromosome (Xi). Unfortunately, they tend to lose expression of the XIST long non-coding RNA, the master regulator of XCI, upon extended culture. This is considered the first sign of future partial reactivation of the Xi, a process known as Xi erosion. The variable state of XCI can compromise research and clinical potentiality of female iPSCs namely on modelling of X-linked diseases affecting women. I set out this project to understand the status of XCI in a co-hort of female iPSCs. First, I assessed XIST expression by RT-qPCR and I identified XIST+ and XIST- iPSCs as well as a XIST- embryonic stem cell and an iPSC with intermediate levels of XIST. Then, I characterize candidate X-linked genes for reactivation by a single-cell method based on nascent transcript RNA FISH and a population-averaged method based on RT-PCR followed by Sanger sequencing for genes presenting genetic variants. My results showed that female iPSCs exhibit considerable variability of XCI patterns. Besides the difference between XIST+ and XIST- iPSCs, the extent of the erosion process was not consistent among XIST- iPSCs. At the gene level, several genes were inert to reactivation in XIST- lines, showing that XIST was dispensable for their silencing. Nonetheless, some genes were found always to be reactivated, while others are only eroded/reactivated in a subset of XIST- iPSCs. These results are important to define the quality criteria for female iPSCs and determine the need to monitor for reactivation of disease-causing X-linked genes ahead of their use in X-linked gene disease modelling.Rocha, Simão José Teixeira daRepositório da Universidade de LisboaEsteves, Cristiano Emanuel Ribeiro2023-12-18T01:31:20Z2021-072021-07-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/51829TID:202902927enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-12-25T01:17:43Zoai:repositorio.ul.pt:10451/51829Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:03:02.183563Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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