Glycine receptor in rat cortical astrocytes: expression and function

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Morais, Tatiana Pinto
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/22471
Resumo: Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015
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spelling Glycine receptor in rat cortical astrocytes: expression and functionGlicinaReceptor da glicinaInibiçãoOndas de cálcioTransientes de cálcioTeses de mestrado - 2015Departamento de Biologia VegetalTese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015In the brain, the inhibitory neurotransmission is mediated by GABA, while in the spinal cord and brainstem is mediated by glycine. Recent studies confirmed the presence of glycinergic transmission markers in the brain, like glycine receptor (GlyR) and transporters. However, GlyR expression in brain astrocytes was not yet described. Astrocytes are now considered active elements in synaptic transmission, acting in a structure named tripartite synapse. They respond to synaptic activity and modulate neuronal response by gliotransmitters release. Such release is controlled by intracellular calcium waves (ICW), the form of astrocytic excitability. The ICW can be propagated to other astrocytes across "gap junctions", leading to a rise in calcium transients (Ca2+T). ICW are the way of astrocytic communication and can occur spontaneously or in response to a stimulus, like ATP. Although GlyR activation has important known brain functions, its effect upon ICW has not been studied. This project’s objective is to explore GlyR expression and function in rat primary cultures of cortical astrocytes. Western blot revealed GlyR and gephyrin expression, while immunofluorescence analysis showed GlyR in the cytoplasm and processes of astrocytes. qPCR further identified GlyR subunits α1, α2 and β within the time in culture. GlyR activation effect upon ATP-induced Ca2+T in astrocytes was evaluated using calcium imaging. Glycine, a GlyR agonist, caused a dose-dependent reduction in Ca2+T, and this effect was abolished by strychnine, a GlyR antagonist. It was also shown that the decrease in Ca2+T is due to an inhibition of calcium release from the endoplasmic reticulum, which is mediated by Cl-. Manipulation of microtubules dynamics, which impairs GlyR anchorage at the cellular membrane, led to a loss of GlyR activation effect. Overall, the results obtained propose an astrocytic GlyR activation-mediated inhibitory effect upon ATP induced Ca2+ transients, which requires GlyR anchorage at the plasma membrane.A neurotransmissão, isto é, a forma de comunicação do sistema nervoso, pode ser inibitória ou excitatória. No sistema nervoso central a neurotransmissão inibitória pode ser mediada por ácido gama aminobutírico (GABA) ou por glicina, tendo estes dois neurotransmissores locais de actuação distintos. Tradicionalmente, o neurotransmissor GABA é descrito como o principal neurotransmissor a actuar no cérebro, enquanto a glicina exerce as suas funções na medula espinal e tronco cerebral. A transmissão excitatória, por sua vez, é da responsabilidade dos neurotransmissores glutamato e aspartato. Porém, evidências recentes mostram a existência de sinapses glicinérgicas no cérebro. Foi já descrita a expressão do receptor de glicina em neurónios e dos transportadores de glicina, tipo 1 e tipo 2, em neurónios e astrócitos. Contudo, a expressão do receptor da glicina em astrócitos não se encontra ainda descrita. Nos últimos 20 anos um novo conceito de sinapse emergiu. Este conceito, denominado “sinapse tripartida”, considera os astrócitos como um elemento activo da transmissão sináptica, capaz de modular e participar na neurotransmissão, e não apenas como mero suporte aos neurónios. Segundo este modelo de sinapse, os astrócitos respondem à actividade neuronal pela libertação de gliotransmissores, isto é, moléculas activas capazes de modular os estímulos sinápticos. Hoje em dia diversos gliotransmissores já foram descritos, tais como o ATP, o glutamate e a D-serina. A libertação destes é controlada pela excitabilidade astrocitária, que se baseia na ocorrência de ondas intracelulares de cálcio, que podem ocorrer espontaneamente ou como resposta a um estímulo. Estas ondas propagam-se para outros astrócitos por “gap junctions”, funcionando como uma forma de comunicação entre astrócitos. O receptor da glicina é um receptor composto por cinco subunidades proteícas, formando um canal pentamérico permeável a cloro. As subunidades que o formam podem ser subunidades α ou β. Se o receptor for apenas formado por subunidades α, diz-se um receptor homomérico e é descrito como exercendo função no espaço extra sináptico. Por sua vez, quando formado por subunidades α e β (3α:2β ou 2α:3β) é um receptor heteromérico e pode ser encontrado no espaço sináptico. O ancoramento do receptor no espaço sináptico é feito pela proteína gefirina, que se liga à subunidade β. O ancoramento na membrana celular depende da migração do receptor do citoplasma até à membrana, sendo esta migração dependente da interacção entre a gefirina e os microtúbulos. Farmacologicamente, o receptor é activado por glicina, β-alanina e taurina, seus agonistas (nesta ordem de potência), enquanto a estriquinina é um potente antagonista selectivo. Este receptor desempenha um importante papel fisiológico em várias zonas do sistema nervoso central, contudo o seu efeito sobre as ondas intracelulares de cálcio, e consequente aumento dos transientes de cálcio intracelulares no encéfalo, não foi anteriormente estudado. Assim, o presente trabalho pretende estudar a função do receptor da glicina, na sinalização entre astrócitos, através da avaliação do seu efeito nas ondas de cálcio, induzidas por ATP, por imagiologia de cálcio em culturas primárias de astrócitos corticais de rato. De forma a confirmar a expressão do receptor da glicina em astrócitos, cortes histológicos de cérebro de rato (12 μm de espessura), com 12 semanas de idade, foram utilizados num ensaio de imunofluorescência. Para a técnica de imunohistoquímica foi efectuada uma marcação dupla. Foram utilizados marcadores dos astrócitos (a proteína GFAP), do receptor de glicina (o anticorpo mAb4a, que identifica o receptor total) e da subunidade 2 do receptor da glicina. Através deste ensaio foi possível observar que no cérebro de rato ocorre a expressão do receptor da glicina em astrócitos, tanto na área do córtex como na área do hipocampo. Após confirmação de que o receptor da glicina é fisiologicamente expresso em astrócitos cerebrais de rato, foram utilizadas culturas primárias de astrócitos de córtex para estudar a expressão do receptor ao longo do tempo em cultura, a sua localização celular e ainda para efectuar uma análise funcional do mesmo. Por western blotting, observa-se que o receptor da glicina, bem como a gefirina, são expressos em culturas de astrócitos sem que ocorram alterações de expressão estatisticamente significativas ao longo do tempo em estudo. Por sua vez, a subunidade β do receptor da glicina apresenta um aumento do nível de expressão ao longo do tempo, sendo este aumento estatisticamente significativo do dia 10 para o dia 18 de cultura. Relativamente aos níveis de expressão de mRNA das subunidades do receptor da glicina, o mRNA da subunidade α1 sofre uma diminuição de expressão ao longo do tempo em cultura, ocorrendo o inverso para a subunidade β. Por sua vez, o nível de expressão de mRNA da subunidade α2 diminui entre o dia 10 e 14 em cultura, ocorrendo posteriormente um aumento de expressão entre o dia 14 e 18. No que respeita à localização celular, avaliada por ensaios de imunocitoquímica, foi encontrada marcação para o receptor, bem como para as suas subunidades α2 e β, no citosol e no espaço perinuclear, ao dia 10, 14 e 18 de cultura. Por sua vez, a gefirina foi detectada no espaço perinuclear e no núcleo. Após a caracterização do receptor da glicina em astrócitos de córtex cerebral foi feita uma avaliação funcional do mesmo. Para este propósito avaliaram-se os efeitos da sua activação por glicina na indução de transientes de cálcio, a forma de excitação astrocitária, através da técnica de imagiologia de cálcio. A perfusão de astrócitos com glicina a 500 μM revelou uma diminuição nos transientes de cálcio intracelulares induzidos por ATP. Este efeito foi revertido quando estriquinina 0.8 μM, um antagonista selectivo do receptor da glicina, é adicionada ao sistema de perfusão, confirmando que o efeito da glicina observado é mediado pelo receptor da glicina. Após observação do efeito inibitório exercido, por activação do receptor da glicina, na indução dos transientes de cálcio nos astrócitos, e sendo o receptor da glicina um canal iónico permeável a cloro, testou-se a hipótese deste efeito ser mediado pela entrada de cloro na célula. Para tal, os astrócitos foram perfundidos com um agonista, muscimol 3 μM, e um antagonista, gabazina 10 μM, do receptor GABA tipo A, um canal iónico permeável a cloro, tal como o receptor da glicina, e que já foi descrito em astrócitos. A perfusão com muscimol mostrou uma diminuição estatisticamente significativa nos transientes de cálcio, que é revertida na presença de gabazina, confirmando assim que o ião cloro é o responsável pela diminuição dos transientes de cálcio. A proteína gefirina, ligada à subunidade β do receptor da glicina, é uma proteína citoplasmática responsável pelo recrutamento e ancoramento do receptor de glicina na membrana celular, onde o receptor é activado, através de um transporte dependente de microtúbulos. Com o objectivo de estudar se o ancoramento do receptor da glicina na membrana altera os efeitos celulares por si mediados, os astrócitos foram perfundidos com nocodazole, um fármaco que afecta a polimerização dos microtúbulos. A perfusão das células com nocodazole 1 μM e glicina 500 μM demonstrou uma perda do efeito inibitório, quando comparado com o caso em que só a glicina é perfundida, revelando assim a necessidade do receptor da glicina estar ancorado na membrana celular para que possa mediar um efeito inibitório sobre os transientes de cálcio induzidos por ATP. Sabendo que após a estimulação por ATP ocorre libertação de cálcio do retículo endoplasmático, surgiu a questão de saber de que forma a activação do receptor de glicina interfere com esta libertação de cálcio da reserva intracelular. Para este fim, as células foram perfundidas com CPA 10 μM, um fármaco que previne a libertação de cálcio do retículo através de cálcio ATPases. Quando as células foram perfundidas com CPA ocorreu uma diminuição nos transientes de cálcio, mas a perfusão simultânea de glicina e CPA suprimiu quase totalmente os transientes de cálcio. Estes resultados revelam uma ligação entre a entrada de cloro para dentro da célula (via activação do receptor de glicina) e a diminuição dos transientes de cálcio, que se deve à inibição da libertação de cálcio do retículo. Depois de confirmada, por ensaios de imagiologia de cálcio, a necessidade de recrutamento do receptor para a membrana celular para potencial activação, foram realizados ensaios de imunocitoquímica em que os astrócitos foram incubados por 10 e por 60 minutos, com glicina ou com glicina e nocodazole. Por imunocitoquímica observou-se que quando os astrócitos são incubados com glicina o receptor de glicina é efectivamente recrutado para a membrana celular, delimitando-a. Por sua vez, quando são incubados com glicina e nocodazole o receptor aparece disperso por todo o citoplasma, não sendo recrutado para a membrana celular. No seu conjunto, os resultados obtidos sugerem que o receptor de glicina é expresso em astrócitos e medeia um efeito inibitório nos transientes de cálcio intracelulares induzidos por ATP quando activado por glicina.Valente, CláudiaGomes, Rui Artur Paiva Loureiro, 1958-Repositório da Universidade de LisboaMorais, Tatiana Pinto2016-01-29T15:22:06Z201520152015-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/22471TID:201071150enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:09:43Zoai:repositorio.ul.pt:10451/22471Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:40:04.347771Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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