Development of Phenylalanine Hydroxylase Enzymosomes for the treatment of Phenylketonuria

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Dias, Adriana dos Santos
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/54111
Resumo: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia
id RCAP_ea3f6d1e4f4bf7ddfdbed6e670b71337
oai_identifier_str oai:repositorio.ul.pt:10451/54111
network_acronym_str RCAP
network_name_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository_id_str 7160
spelling Development of Phenylalanine Hydroxylase Enzymosomes for the treatment of PhenylketonuriaHuman phenylalanine hydroxylasePhenylketonuriaEnzyme reposition therapyEnzymosomesProtein acetylthyolationTeses de mestrado -2021Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de FarmáciaA fenilcetonúria (PKU) é a doença genética rara que afeta com maior prevalência o metabolismo de aminoácidos. Esta doença é causada por mutações que afetam o gene PAH que codifica para a enzima fenilalanina hidroxilase humana (hPAH), expressa maioritariamente nos hepatócitos. Esta proteína é responsável pela conversão de fenilalanina (L-Phe) em tirosina (L-Tyr) na presença do cofator tetrahidrobiopterina (BH4), oxigénio molecular e de Fe(II) não hemíco presente no centro ativo. Atualmente, continua a haver urgência no desenvolvimento de novas terapias para a PKU, sendo que as frequentemente utilizadas envolvem uma restrição alimentar (terapia dietética) e a suplementação com o cofator BH4. A hPAH é um homotetrâmero em que cada subunidade (≈ 50 kDa) apresenta um domínio regulador N-terminal, um domínio catalítico e um domínio de oligomerização C-terminal responsável pela dimerização e consequente tetramerização. Uma terapia de reposição enzimática (ERT) envolvendo a administração de hPAH é presentemente um desafio devido em parte à instabilidade da proteína (elevada sensibilidade às condições do meio), à elevada massa molecular (≈200 kDa), necessidade da presença de tetrâmeros e do cofactoe enzimático exercer a sua função no ambiente biológico. Uma solução atrativa para ultrapassar estes constrangimentos envolve a formulação da proteína mantendo a sua estabilidade e funcionalidade e de um bom sistema de distribuição biofarmacológica, como os enzimossomas. Neste trabalho são apresentados os resultados obtidos na otimização das condições de modificação da hPAH para futuramente ligar covalentemente a enzima a lipossomas vazios produzindo enzimossomas. A hPAH recombinante foi expressa em E. coli e purificada através do recurso a uma cromatografia de afinidade com iões imobilizados. As espécies tetraméricas, posteriormente isoladas por cromatografia de exclusão molecular, foram modificadas usando diferentes razões de agente modificador:hPAH (8:1; 16:1 e 24:1), sendo utilizado como agente modificador o N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA). A hPAH modificada foi isolada e caracterizada em termos de rendimento de proteína recuperada, grau de modificação, atividade enzimática com pré-ativação por L-Phe, termoestabilidade e conformação quaternária. Através da comparação dos resultados obtidos com os da hPAH não-modificada, mas sujeita às mesmas condições reacionais da proteína modificada, observou-se alterações mínimas na atividade enzimática e um ligeiro aumento na termoestabilidade (parâmetro Tm) da proteína modificada. Estes dados indicam que a hPAH modificada preserva a sua função catalítica e estabilidade. Este trabalho permitiu assim estabelecer as condições experimentais para no futuro ligar covalentemente a proteína modificada a lipossomas vazios formando enzimosomas.Phenylketonuria (PKU) is the most prevalent genetic disorder of the amino acid metabolism, and is due to mutations affecting the PAH gene which encodes for human phenylalanine hydroxylase (hPAH), manly expressed in hepatocytes. This protein is responsible for the conversion of phenylalanine (L-Phe) into tyrosine (L-Tyr) in the presence of tetrahydrobiopterin (BH4) as the cofactor, Fe(II) and molecular oxygen. Presently, more efficient therapies are still needed, being dietetic restriction and cofactor supplementation the main available approaches to treat PKU patients. Human PAH is a homotetrameric enzyme with each subunit (≈ 50 kDa) presenting an N-terminal regulatory domain, a catalytic domain and a C-terminal oligomerization domain responsible for dimerization and subsequent tetramerization. An enzyme reposition therapy (ERT) involving hPAH administration is challenging mainly due to the protein instability (high sensitivity to environment conditions), high molecular mass (≈200 kDa), necessary maintenance of the biologic tetrameric state and need for the cofactor. An attractive approach to overcome these constraints involves the formulation of a stable protein as well the design of a drug delivery system, namely as enzymosomes. In this work, the procedures performed to optimize the assay conditions for hPAH modification for further covalent attach the enzyme to empty liposomes producing enzymosome are described. To reach this goal, recombinant hPAH was produced in E. coli and purified using an immobilized metal affinity chromatography. The homotetrameric species, isolated by size exclusion chromatography, were modified using different ratios of modifier agent:hPAH (8:1; 16:1 and 24:1) using N-succinimidyl S-acethylthioacetate (SATA) as the modifier agent. The successfully modified hPAH was isolated and tested for protein recovery, degree of modification, enzymatic activity with L-Phe pre-activation, thermostability, and quaternary structure. By comparing the obtained data with those found for the nonmodified hPAH, minimal changes in the enzymatic activity and a slight increase in the melting temperature (Tm) of the modified hPAH were observed. These data demonstrate that the modified protein preserves the catalytic function and stability. It is now possible to continue the studies and covalently attach the modified hPAH to liposome preparations thus obtaining enzymosomes.Com o patrocínio da Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa.Leandro, Ana Paula Costa dos Santos PeraltaCorvo, LuisaRepositório da Universidade de LisboaDias, Adriana dos Santos2024-01-25T01:34:10Z2021-01-252020-12-182021-01-25T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/54111TID:202991890enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-01-29T01:19:23Zoai:repositorio.ul.pt:10451/54111Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:05:05.182759Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
dc.title.none.fl_str_mv Development of Phenylalanine Hydroxylase Enzymosomes for the treatment of Phenylketonuria
title Development of Phenylalanine Hydroxylase Enzymosomes for the treatment of Phenylketonuria
spellingShingle Development of Phenylalanine Hydroxylase Enzymosomes for the treatment of Phenylketonuria
Dias, Adriana dos Santos
Human phenylalanine hydroxylase
Phenylketonuria
Enzyme reposition therapy
Enzymosomes
Protein acetylthyolation
Teses de mestrado -2021
Ciências da Saúde
title_short Development of Phenylalanine Hydroxylase Enzymosomes for the treatment of Phenylketonuria
title_full Development of Phenylalanine Hydroxylase Enzymosomes for the treatment of Phenylketonuria
title_fullStr Development of Phenylalanine Hydroxylase Enzymosomes for the treatment of Phenylketonuria
title_full_unstemmed Development of Phenylalanine Hydroxylase Enzymosomes for the treatment of Phenylketonuria
title_sort Development of Phenylalanine Hydroxylase Enzymosomes for the treatment of Phenylketonuria
author Dias, Adriana dos Santos
author_facet Dias, Adriana dos Santos
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Leandro, Ana Paula Costa dos Santos Peralta
Corvo, Luisa
Repositório da Universidade de Lisboa
dc.contributor.author.fl_str_mv Dias, Adriana dos Santos
dc.subject.por.fl_str_mv Human phenylalanine hydroxylase
Phenylketonuria
Enzyme reposition therapy
Enzymosomes
Protein acetylthyolation
Teses de mestrado -2021
Ciências da Saúde
topic Human phenylalanine hydroxylase
Phenylketonuria
Enzyme reposition therapy
Enzymosomes
Protein acetylthyolation
Teses de mestrado -2021
Ciências da Saúde
description Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia
publishDate 2020
dc.date.none.fl_str_mv 2020-12-18
2021-01-25
2021-01-25T00:00:00Z
2024-01-25T01:34:10Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv http://hdl.handle.net/10451/54111
TID:202991890
url http://hdl.handle.net/10451/54111
identifier_str_mv TID:202991890
dc.language.iso.fl_str_mv eng
language eng
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron:RCAAP
instname_str Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
instacron_str RCAAP
institution RCAAP
reponame_str Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
collection Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
repository.name.fl_str_mv Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informação
repository.mail.fl_str_mv
_version_ 1799134602537730048

Registros relacionados