Advances in the development of a stable transfection system for Babesia ovis
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| Data de Publicação: | 2018 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/39293 |
Resumo: | Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018 |
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Advances in the development of a stable transfection system for Babesia ovisBbesia ovistransient transfectionelongation factor -lalphaplasmid constructionluciferasesensitivity assaysTeses de mestrado - 2018Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018Babesia species, etiological agents of babesiosis, a recognized emerging vector-borne zoonose, are a significant animal and human health concern with a worldwide socio-economic impact. Genetic manipulation methods are pivotal to improve knowledge regarding the biology of these poorly studied parasites towards better disease control strategies. For Babesia ovis, responsible for ovine babesiosis, a tick-borne disease of small ruminants, these tools are not yet available. Transfection technologies have a wide range of applications, being particularly useful in the study of the parasite-host cell interactions. The establishment of parasites expressing a fluorescent marker has allowed imaging of tick vector colonization, an approach that can also be applied to clarify B. ovis and related Babesia spp. life cycle events in the tick vector tissues. Thus, the main goal of this study was to set up basis for the development of a stable transfection system, driving expression of a fluorescent marker for B. ovis. The present work has four objectives, (1) screening of regulatory regions in B. ovis genome and/or identification of heterologous promoters from other Babesia species, (2) development of transient transfection systems with the previously selected regions and evaluation of transfection conditions, promoter activity, transfection efficiency, (3) identification of a proper selection system for upcoming stable transfection of B. ovis and (4) the development of the plasmid construct for B. ovis stable transfection. The study was based on the existence of interchangeable cross-species functional promoters between Babesia species. Therefore, first steps consisted in the development of transient transfection constructs with elongation factor 1-alpha (ef-1α) promoter regions from B. bovis and B. ovata to drive expression of the luciferase reporter gene. A promoterless plasmid was also developed to use as negative control in the luminescence assays. Herein, we describe for the first time B. ovis transient transfection using heterologous promoters, the ef-1α-B intergenic regions from B. bovis and B. ovata. Their ability to drive expression of a reporter luciferase in B. ovis supports their cross-species functionality. The ef-1α-B promoter region from B. ovata resulted in the expression of high luciferase levels, thus an appropriate promoter for stable gene expression. Transfection efficiency was evaluated through qPCR to preclude the hypothesis that higher luminescence values were related with a higher transfection efficiency. Based on available sequences from B. bovis, B. bigemina and B. divergens, PCR experiments were performed aiming the search for regulatory elements in B. ovis genome. Analysis of the actin 5’ flanking region revealed homology with B. bovis actin promoter but curiously the absence of a transcriptional start site consensus motif common between B. bovis and Theileria species. Regarding ef-1α and rhoptry associated protein -1 (rap-1) locus, their organization in B. ovis remains unclear but it was possible to retrieve a rap-1 intergenic region with transcription termination signals, essential for the development of future autologous transfection systems. Also, a potential region for stable construct integration has been sequenced, the ef-1α gene. Evaluation of B. ovis sensitivity to WR99210 and blasticidin-S, antibiotics commonly used to select apicomplexan transfectants, has been performed and blasticidin-S was identified as a selectable marker for future stably transfected B. ovis. Currently, efforts are being conducted in the construction of a stable transfection plasmid with the ef-1α-B promoter region from B. ovata driving expression of a fluorescent reporter gene and an antibiotic resistance gene. The establishment of a B. ovis lineage expressing a fluorescent reporter gene will be applied to study B. ovis life cycle, enlightening interactions with the host cells.Os parasitas do género Babesia são agentes etiológicos de babesiose, uma zoonose emergente transmitida por carraças, reconhecida com uma ameaça importante para a saúde animal e humana e com um impacto socioeconómico a nível mundial. Métodos de manipulação genética são essenciais para o conhecimento da biologia destes pouco estudados organismos, de forma a melhorar as estratégias para o seu controlo. Em Babesia ovis, agente responsável pela babesiose ovina, tais metodologias não foram, até à data, desenvolvidas. A transfecção é uma metodologia que têm inúmeras aplicações, sendo particularmente útil no estudo de interações parasita-célula hospedeira. O estabelecimento de uma linhagem de parasitas a expressar um marcador fluorescente permitiu monitorizar a colonização do vector pelo agente patogénico. Esta estratégia pode ser também aplicada para clarificar eventos do ciclo de vida de B. ovis e de outras espécies do género Babesia, na carraça vector. Desta forma, o principal objetivo do presente estudo foi o de criar os pilares necessários ao desenvolvimento de um sistema para transfecção estável capaz de expressar um marcador fluorescente em B. ovis. O presente trabalho apresenta quatro objetivos, (1) o screening de regiões reguladoras no genoma de B. ovis e/ou a identificação de promotores heterólogos noutras espécies do género Babesia, (2) o desenvolvimento de sistemas para transfecção transiente com as regiões reguladoras previamente selecionadas bem como a avaliação de parâmetros da transfecção, atividade das regiões promotoras e eficiência da transfecção, (3) identificação de um sistema de seleção apropriado para isolar B. ovis transfectada de forma estável e (4) o desenvolvimento de um plasmídeo para transfecção estável de B. ovis. Este estudo baseou-se na existência de promotores funcionais e intercambiáveis entre espécies do género Babesia. Sendo assim, o trabalho iniciou com o desenvolvimento de plasmídeos para transfecção transiente contendo uma das regiões promotoras do factor de elongação-1alfa (ef-1α) de B. bovis e B. ovata permitindo a expressão do gene repórter que codifica para a luciferase. O presente trabalho descreve, pela primeira vez, a transfecção transiente de B. ovis, sendo que ambas as regiões promotoras utilizadas permitiram a expressão da luciferase em B. ovis corroborando a sua funcionalidade entre espécies. Em particular a região promotora de B. ovata induziu a expressão de níveis elevados de luciferase, revelando ser uma região promotora adequada para incorporar num sistema que permita uma transfecção estável. A eficiência de transfecção foi avaliada através de análise por qPCR de forma a validar que as diferenças observadas nos valores de luminescência não estavam relacionadas com diferenças na eficiência do processo de transfecção. Tendo por base sequências de B. bovis, B. bigemina e B. divergens, foram realizados PCR com objetivo de amplificar regiões reguladoras no genoma de B. ovis. Análise da região 5’ flanqueante da actina revelou homologia com a região promotora da actina em B. bovis, embora, curiosamente, a sequência consenso em B. bovis e espécies do género Theileria para iniciação da transcrição estivesse ausente. Relativamente ao locus do ef-1α e da rhoptry associated protein -1 (rap-1), a sua organização ainda não está esclarecida tendo sido possível obter a região intergénica de rap-1. Esta região apresenta sinais de terminação podendo ser utilizada para um futuro sistema para transfecção constituído por regiões reguladoras autólogas. Foi ainda sequenciada uma possível região para integração de um construto estável no genoma de B. ovis, o gene ef-1α. A blasticidina-S foi selecionada como agente selector de B.ovis transfectados após ensaios de suscetibilidade aos antibióticos WR99210 e blasticidina-S, comummente utilizados para selecionar espécies transfectada do filo apicomplexa. O desenvolvimento de um plasmídeo para transfecção estável está em curso o que permitirá estabelecer uma linhagem de B. ovis a expressar a proteína fluorescente vermelha (RFP). Os resultados do presente trabalho decerto irão contribuir para melhor compreender o parasita bem como interações com células hospedeiras.Project was partially supported by National Funds through Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/CVT-EPI/4339/2012 and PTDC/CVT-WEL/1807/2014)Antunes, Sandra Isabel da ConceiçãoPimentel, Madalena Maria VilelaRepositório da Universidade de LisboaRosa, Catarina Maria da Silva2019-12-13T01:30:21Z2018-12-1320182018-12-13T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/39293TID:202251810enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:37:46Zoai:repositorio.ul.pt:10451/39293Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:53:04.539059Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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