Stimulus responsive smart supports and scaffold/cell constructs for bone tissue engineering
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2009 |
Idioma: | eng |
Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
Texto Completo: | http://hdl.handle.net/1822/9873 |
Resumo: | Tese de doutoramento em Engenharia Biomédica |
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Stimulus responsive smart supports and scaffold/cell constructs for bone tissue engineeringSuportes inteligentes com capacidade de responder a estímulos e novas combinações suportes/células para engenharia de tecidos ósseos611-018.4Tese de doutoramento em Engenharia BiomédicaTissue engineering (TE) has emerged as a new interdisciplinary science for the repair of various tissues, restoring their functions by means of using biomaterials, cells, and/or bioactive factors. Three main general strategies have been adopted for the creation of new bone tissue: i) direct in vivo implantation of isolated cells; ii) direct in vivo implantation of scaffolds; and iii) cells placed on or within scaffolds. In the bone tissue engineering approach, a temporary scaffold is required to serve as an adhesive substrate for the implanted cells and a physical support to guide the formation of the new tissue. In the second and third approaches, a porous material acts as a scaffold, serving in the later case as transplant vehicle for cultured cells and template to guide tissue regeneration, playing an important role in transforming the cell seeded scaffolds in to a new tissue. The present thesis is divided in two main groups of studies: in the first one we describe the TE strategy of using scaffold and seeded cells with osteogenic media supplemented with several enzymes (Chapter III and IV). The second part describes the development of acellular scaffolds with in situ pore forming ability in vitro, improvement of their properties (namely degradation and osteoconductivity) and finally the validation of in situ pore forming concept in vivo (Chapters V, VI, VII and VIII). Previously, it was demonstrated that starch/poly(ε-caprolactone) fiber mesh scaffolds have induced osteogenic differentiation of rat bone marrow stromal cells (MSCs) when cultured in flow perfusion bioreactors. The studies described in Chapters III and IV aimed to investigate the effect of complete osteogenic media supplemented with different enzymes in physiological concentrations similar to those found in human serum. The influence of these enzymes on the degradation of SPCL fiber meshes and on the osteogenic differentiation of MSCs seeded onto scaffolds was assessed. These studies were performed in static cultures and in flow perfusion bioreactors. After degradation studies in static and dynamic conditions in the presence of enzymes showed that SPCL did not lose its structural integrity. α-amylase had a remarkable effect on the degradation, increasing porosity and pore size of SPCL in both static and dynamic conditions. It was demonstrated that supplementation of culture media with lipase enhances the osteoblastic differentiation of the seeded MSCs and promotes matrix mineralization in static cultures. When flow perfusion bioreactors were used, the flow enhanced the infiltration of cells and facilitated better distribution of extracellular matrix throughout the scaffolds in the presence/absence of enzymes. The presence of flow and lipase improved the osteogenic differentiation of MSCs as compared with the other groups, enhanced mineralization and promoted uniform matrix distribution. The second part of this thesis (Chapters V, VI, VII and VIII) described the development of almost nonporous chitosan and chitosan/starch scaffolds, with the ability of forming a porous structure in situ due to the attack by specific enzymes present in the human body (α-amylase and lysozyme). The results of the compressive tests showed that these scaffolds exhibit very good mechanical properties in both the dry and wet state. Degradation studies were performed using α-amylase and/or lysozyme at concentrations similar to those found in human serum and showed that after enzymatic degradation there was the formation of a porous structure, indicating the potential of this methodology to obtain in situ forming scaffolds. Citotoxicity test revealed that the extracts of the materials were clearly non-toxic to L929 fibroblast cells. Analysis of cell adhesion and morphology of seeded osteoblastic-like cells in direct contact tests showed that the number of cells on chitosan/starch scaffolds was noticeably higher than that on chitosan scaffolds, which suggest that starch containing materials may promote cell adhesion and proliferation. In order to improve the in situ pore forming scaffolds, a self-regulated degrading material with gradual in situ pore formation were developed. This approach is based on the incorporation of the lysozyme enzyme into biomimetic calcium phosphate (CaP) coatings. These coatings were prepared on the surface of chitosan scaffolds by means of a biomimetic coating technique, with the aim of controlling their degradation rate and preventing infection upon implantation. Two different environments were simulated: normal physiological conditions (pH 7.4) and inflammatory response (pH 5). At pH 7.4, the scaffolds remained more stable than those incubated at pH 5, which showed a rapid decrease in their initial weight and the formation of a highly porous structure. Additional studies investigated the influence of a CaP biomimetic coating on osteogenic differentiation of rat marrow stromal cells (MSCs) and showed enhanced differentiation of rat MSCs seeded on the CaP coated chitosan-based scaffolds with lysozyme incorporated. At all culture times, CaP coated chitosan-based scaffolds with incorporated lysozyme enhanced osteoblastic differentiation of MSCs, bone matrix production, and mineralization. The ability of these CaP coated chitosan-based scaffolds with incorporated lysozyme to create an interconnected pore network in situ coupled with its positive effect on osteoblastic differentiation of MSCs and the production of mineralized matrix illustrate the strong potential of these scaffolds for application in bone tissue engineering strategies. In order to validate the concept in vivo, a rat subcutaneous model was used to investigate the degradation of the scaffolds and the in situ pore formation. All scaffolds showed pronounced weight loss and pore formation as a function of time. All group conditions showed a significant increase in porosity after 12 weeks. After all time points no adverse tissue reaction was observed, and as degradation increased, histological analysis showed cells ingrowth throughout the implants. Using this innovative methodology, the ability of gradual in situ pore formation of these novel scaffolds was demonstrated in vivo. As a concluding remark, it can be stated that the studies performed in this thesis proposed several successful strategies that might find application in a bone tissue engineering scenario.A Engenharia de Tecidos é uma ciência interdisciplinar recente que visa reparar diferentes tecidos, recuperando as suas funções usando biomateriais, células e/ou agentes bioactivos. As três estratégias que têm sido usadas para a criação de novo tecido ósseo incluem: i) implantação de células; ii) implantação de suportes tridimensionais; e iii) combinação das duas estratégias anteriores, usando células cultivadas nos suportes. Na engenharia de tecidos ósseos, os suportes são usados como substrato para células e também como suporte físico para as mesmas de forma a induzir a formação de novo tecido ósseo. Na segunda e terceira estratégias, descritas anteriormente, um material poroso funciona como suporte para cultura de células e para induzir a regeneração óssea, tendo um papel importante na diferenciação de células no tecido desejado. Esta tese divide-se em dois estudos principais: o primeiro que descreve a estratégia de engenharia de tecidos utilizando um suporte poroso e células cultivadas no mesmo, usando meio osteogénico enriquecido com diferentes enzimas (Capítulos III e IV). A segunda parte desta tese descreve o desenvolvimento de suportes não porosos com a capacidade de formação de poros in situ, aperfeiçoamento das suas propriedades (nomeadamente no que respeita a degradação e osteoconductividade) e por último, a confirmação do conceito de formação de poros in situ nos suportes inteligentes quando implantados in vivo (Capítulos V, VI, VII e VIII). Os estudos apresentados nos Capítulos IIII e IV tiveram como objectivo investigar o efeito do meio osteogénico enriquecido com diferentes enzimas em concentrações fisiológicas semelhantes às encontradas no soro humano. Estudou-se a influência destas enzimas na degradação de suportes porosos à base de amido e policaprolactona (SPCL) e na diferenciação osteogénica de células da medula óssea de rato. Estes estudos foram efectuados em condições estáticas e usando bioreactores de perfusão. Os estudos de degradação em condições estáticas e dinâmicas mostraram que na presença das enzimas, os suportes de SPCL não perderam a sua estrutura física. A α-amilase teve um efeito significativo na degradação dos suportes de SPCL, aumentando a sua porosidade e o tamanho de poros em condições estáticas e dinâmicas. Demonstrou-se também que a lipase no meio osteogénico melhorou a diferenciação osteogénica das células cultivadas nos suportes de SPCL e estimulou a mineralização da matriz extracelular em condições estáticas. Quando foram usados bioreactores de perfusão, verificou-se que o fluxo melhorou a infiltração das células e permitiu uma melhor distribuição de matriz extracelular no interior dos suportes. A combinação do fluxo (gerado pelos bioreactores) e a presença de lipase permitiram obter melhores resultados no que respeita a diferenciação osteogénica das células da medula óssea em todos os grupos estudados, induzindo mais mineralização e distribuição da matriz extracelular. A segunda parte desta tese (Capítulos V, VI, VII and VIII) descreve o desenvolvimento de suportes não porosos à base de quitosano e combinação de quitosano com amido, com a capacidade de formarem uma estrutura porosa in situ devido à acção de enzimas específicas (α-amilase e lisozima – enzimas existentes no corpo humano). Os resultados dos estudos de compressão mostraram que estes suportes têm propriedades mecânicas adequadas quando estudados nos estados seco e molhado. Os estudos de degradação foram efectuados usando α-amilase e/ou lisozima em concentrações semelhantes às encontradas no soro humano e mostraram que induziram a formação de uma estrutura porosa, demonstrando o potencial destes suportes inteligentes com capacidade para responder a estímulos. Os testes de citotoxicidade com fibroblastos L929 mostraram a ausência de toxicidade dos extractos dos materiais. Os testes de contacto directo com uma linha celular de osteoblastos mostraram que o número de células nos suportes à base de quitosano e amido era maior do que nos suportes de quitosano, sugerindo que o amido pode promover a adesão e proliferação celular. Desenvolveram-se suportes inteligentes com capacidade de responder a estímulos de forma a melhorar o comportamento dos suportes com capacidade de formação de poros in situ. Esta estratégia incluiu a incorporação de lisozima em revestimentos de fosfato de cálcio na superfície de suportes de quitosano usando a técnica de revestimentos biomiméticos com o objectivo de controlar a degradação dos suportes e prevenir infecções. Foram simuladas duas condições: condições fisiológicas normais (pH 7.4) e de resposta inflamatória (pH 5). A pH 7.4, os suportes mantiveram-se estáveis comparativamente aos estudados a pH 5, que mostraram um decréscimo de peso e a formação de estruturas porosas. Estudos adicionais investigaram a influência dos revestimentos de fosfato de cálcio na diferenciação osteogénica de células da medula óssea e mostraram que estas diferenciaram-se na presença de lisozima. Em todos os tempos de cultura observou-se que os suportes de quitosano revestidos com fosfatos de cálcio e na presença de lisozima tiveram um melhor comportamento do que os restantes grupos estudados, nomeadamente na produção e mineralização da matriz extracelular. A capacidade destes suportes inteligentes em responder a estímulos e formar estruturas porosas, juntamente com o efeito positivo na diferenciação osteogénica de células da medula óssea, ilustram o potencial destes suportes para aplicações na área de engenharia de tecidos ósseos. Por último, pretendeu-se confirmar o conceito de formação de poros in vivo. Diferentes tipos de suportes à base de quitosano e amido, revestidos ou não com fosfatos de cálcio e na presença/ausência de lisozima foram implantados em ratos usando um modelo subcutâneo. Os principais objectivos incluíram o estudo da degradação in vivo dos suportes e a formação de poros in situ. Todos os suportes apresentaram elevada perda de peso e formação de poros em função do tempo de implantação. Adicionalmente, todos os grupos mostram um aumento significativo na sua porosidade após 12 semanas. Em todos os tempos de implantação não foram detectadas reacções adversas e, conforme a degradação aumentou, as secções histológicas mostraram infiltração de células nos implantes. Esta metodologia inovadora mostrou a capacidade destes suportes inteligentes em responder a estímulos e deste modo serem capazes de induzir per se a formação de estruturas porosas. As observações discutidas nesta tese propõem diferentes estratégias que poderão ser usadas com sucesso na área de engenharia de tecidos ósseos.European NoE EXPERTISSUES - NMP3-CT-2004-500283European STREP HIPPOCRATES - NMP3-CT-2003-505758Reis, R. L.Alves, Catarina Vieira MonizMikos, A. G.Universidade do MinhoSousa, Ana Margarida Martins de2009-11-092009-11-09T00:00:00Zdoctoral thesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/1822/9873enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-05-11T07:24:25Zoai:repositorium.sdum.uminho.pt:1822/9873Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openairemluisa.alvim@gmail.comopendoar:71602024-05-11T07:24:25Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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