Influence of histone octamer core distortion on nucleosome thermal mobility
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| Data de Publicação: | 2018 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/35293 |
Resumo: | Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018 |
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Influence of histone octamer core distortion on nucleosome thermal mobilityNucleossomaCódigo de histonasModificações pós-traducionaisEpigenéticaCromatinaTeses de mestrado - 2018Domínio/Área Científica::Ciências Naturais::Ciências QuímicasTese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018O nucleossoma é a subunidade fundamental da cromatina eucariótica. As histonas, proteínas características do nucleossoma, são pequenas proteínas básicas subdivididas em duas superfamílias: linker (H1) e core (H2A, H2B, H3 e H4). As histonas core oligomerizam para formar o octamero de histonas que, conjuntamente com ADN de cadeia dupla, estabelecem a estrutura complexa do nucleossoma. A estrutura do nucleossoma foi inicialmente identificada em 1975 recorrendo à digestão da cromatina por uma nuclease micrococal, sendo que apenas em 1997 foi divulgada a estrutura do nucleossoma obtida por difração de raios-X com uma resolução de 2.8 Å, e mais tarde, em 2002, com uma resolução de 1.9 Å, o que revela ser mais do que suficiente para as cadeias laterais e a cadeia principal serem observadas com elevado grau de confiança. As histonas partilham um domínio entre elas: o histone fold, constituído por cerca de 70 resíduos de aminoácidos, capaz de facilitar a heterodimerização das histonas e que se encontra localizado na região C-terminal e consiste em três hélices-α (α1, α2 e α3) ligadas entre si por dois loops (L1 e L2) flanqueando a hélice-α 2. As histonas são constituídas por um domínio globular e uma região N-terminal flexível rica em resíduos de lisina e arginina. Estas proteínas heterodimerizam com o auxílio de interações hidrofóbicas, formando o handshake motif. No contexto celular, o nucleossoma permite o empacotamento do genoma no espaço relativamente limitado disponível dentro do núcleo, através do folding numa série de estruturas moleculares de ordem gradualmente superior. Mais ainda, permite a regulação temporal e espacial de vários processos modelados pelo ADN, como por exemplo a transcrição, a replicação e o reparo de ADN, necessários para que as células prosperem e exerçam as suas funções. Desde a sua descoberta na década de 1960, as modificações pós-tradicionais de histonas (e.g. metilação, fosforilação e acetilação) foram associadas à regulação da expressão génica, com algumas modificações sendo associadas à ativação de genes, enquanto outras foram associadas ao seu silenciamento. Vários estudos demonstraram a existência de um “código de histonas” que estipula que diferentes modificações pós-tradicionais nas histonas afetam as afinidades de ligação de proteínas capazes de estabelecerem uma ligação à cromatina, levando a estados transcricionais alterados do ADN subjacente. A informação epigenética codificada por estas modificações que ocorrem nas histonas pode ser passada para a próxima geração de células, agindo como uma camada adicional de informação que pode ser armazenada dentro da célula, aumentando ainda mais a complexidade e a variabilidade do material genético. Foi previamente demonstrado que o nucleossoma exibe um deslocamento, quando incubado a altas temperaturas, para os terminais da molécula de ADN que está enrolada em volta do nucleossoma. Neste contexto, o presente projeto visa observar a influência da distorção do octamero de histonas na mobilidade térmica do nucleossoma. Deste modo, vários mutantes de histonas foram preparados, embora apenas um nucleossoma mutante tenha sido gerado, além do nucleossoma wild-type. Para a obtenção de histonas recombinantes com elevado grau de pureza, recorreu-se a técnicas cromatográficas. Em primeiro lugar, foram expressas histonas recombinantes (wild-type e mutantes) em células Escherichia coli BL21 (DE3) Rosetta competentes a partir de plasmídeos in house. As histonas core H2A e H2B, bem como H3 e H4, foram coexpressas, uma vez que a coexpressão destes dois pares de proteínas reduz o tempo necessário para a sua síntese, para além de produzir complexos solúveis passíveis de serem purificados por sucessivas técnicas experimentais. Posteriormente, executou-se a purificação das mesmas através do uso de uma cromatografia de afinidade seguida duma cromatografia de troca iónica. Após todas as histonas terem sido geradas em grandes quantidades e elevado grau de pureza, efetuou-se a montagem do octamero. Paralelamente, foi sintetizada a sequência Widom 601, previamente descrita na literatura como sendo uma sequência de muito alta afinidade para o nucleossoma, via PCR usando primers apropriados. Neste trabalho foram geradas duas variantes da sequência supramencionada: curta (147 pb) e longa (227 pb). Uma vez obtidos todos os componentes necessários para a montagem do nucleossoma, recorreu-se à reconstituição do mesmo através de diálises (com gradiente de salinidade). Por fim, os nucleossomas gerados foram usados para serem efetuados thermal shift assays e native gel shift assays. Os thermal shift assays foram usados para se observar o deslocamento do nucleossoma ao longo do ADN (baseado na sequência Widom 601) e o efeito da distorção do octamero na mobilidade do nucleossoma induzida pela temperatura. Quanto aos native gel shift assays, um ensaio experimental rápido e sensível para a deteção de interações proteína-ácido nucleico, foram usados para observar a afinidade de ligação de diversas proteínas com ligação putativa à cromatina. Este trabalho corroborou o padrão observado de deslocamento de nucleossomas wild-type para as extremidades do ADN associado ao mesmo. O nucleossoma mutante H4_V43C H3_F104C concebido neste projeto demonstrou estar associado ao aumento da integridade estrutural e rigidez do nucleossoma, possivelmente através do estabelecimento de uma ponte dissulfeto entre L1 (loop 1) da histona H4 e 2 (hélice- 2) da histona H3. O estudo do impacto da plasticidade do octamero de histonas, consequência das diversas modificações que podem ocorrer nos seus resíduos de aminoácidos e que levam à distorção do core de histonas, é relevante no sentido de tentar entender o seu papel na regulação da expressão génica. Uma dada mutação irá, hipoteticamente, reforçar a estrutura do nucleossoma, potencialmente impossibilitando o acesso do complexo basal de transcrição, devido à alteração da capacidade de mobilidade do nucleossoma em relação ao ADN, e silenciando o(s) gene(s) codificados no ADN subjacente que se encontra “blindado” pelo nucleossoma, e vice-versa. Também será possível que alguns complexos capazes de remodelar a cromatina possam tirar partido da alteração da integridade estrutural conferida pelas diversas mutações ou pela presença de variantes de histonas. Numa visão geral, os resultados obtidos neste projeto demonstraram que é necessária uma certa plasticidade do octamero de histonas para se observar o movimento não-catalisado do nucleossoma. Adicionalmente, foi tentada a análise da Fkbp39, uma peptidilprolil isomerase com um domínio NPL (nucleoplasmin-like) conservado na região N-terminal, que se pensa ser uma chaperona de histonas em S. pombe e que é responsável pelo aumento da taxa de isomerização cis-trans das prolinas na cauda N-terminal (região N-terminal flexível) da histona H3. A análise foi feita por criomicroscopia eletrónica, tanto com a Fkbp39 não-complexada, como em complexo com (H2A-H2B) e com (H3-H4)2. Nesse sentido, expressou-se a proteína Fkbp39 em células E. coli BL21 (DE3) Rosetta competentes e foi executada a sua purificação com elevado grau de pureza através do uso de diferentes técnicas cromatográficas (cromatografias de afinidade, de troca iónica, e de exclusão molecular). Embora as purificações tenham sido bem-sucedidas, nem a proteína Fkbp39 isolada, nem em complexo com o dímero (H2A-H2B) ou com o tetramero (H3-H4)2 foram passíveis de serem observadas por criomicroscopia electrónica. É possível que, devido à presença de uma região central dinâmica intrinsecamente desordenada, estratégias sucessivas de otimização sejam necessárias para estabilizar os complexos putativos. Por último, várias proteínas putativas de ligação à cromatina foram rastreadas quanto à ligação aos nucleossomas sintetizados neste projeto recorrendo a native gel shift assays. Hpf1 (Histone PARylation factor 1), Parp2 (Poly [ADP-ribose] polymerase 2) e Alf (TFIIA-alpha and beta-like factor), provenientes de Homo sapiens, demonstraram ser os melhores candidatos para estudos estruturais posteriores mais aprofundados para averiguar com maior confiança as suas afinidades de ligação à cromatina.The nucleosome is the fundamental repeating subunit of eukaryotic chromatin. The histones, hallmarks of the nucleosome, are small basic proteins subdivided into two super families: linker (H1) and core histones (H2A, H2B, H3 and H4). Core histones assemble together to form the histone octamer which then, together with double-stranded DNA, embodies the complex structure of the nucleosome. Most importantly, the nucleosome allows for the tight packaging of the large genome into the relatively constricted space available inside the nucleus by folding into a series of higher-order molecular structures. Furthermore, it allows for the fine-tuned temporal and spatial regulation of several DNA-templated processes, such as DNA transcription, replication and repair, unequivocally required for the cells to thrive and exert their functions. Since their discovery in the 1960s, histone post-translational modifications (e.g. methylation, phosphorylation and acetylation) have been shown to affect gene expression regulation, with some modifications being associated with gene activation, whilst others have been associated with gene silencing. Interestingly, several studies have demonstrated the existence of a “histone code” which states that the presence of post-translational modifications on histones affect binding affinities of chromatin-binding proteins leading to altered transcriptional states of the underlying DNA. The epigenetic information encoded via these modifications occurring on histones can be passed on to the next generation of cells, acting as an additional layer of information that can be stored inside the cell, further increasing the complexity and versatility of the genetic material. It has been shown that the nucleosome exhibits shifting when incubated at high temperatures towards the DNA ends in regard to the nucleosomal DNA. In this context, the current project aims to observe the influence of histone octamer core distortion on nucleosome thermal mobility. To do so, several histone mutants were prepared, albeit only one mutant nucleosome was assembled, apart from the wild-type nucleosome. This work corroborates the observed thermally-driven shifting pattern of wild-type nucleosomes. The H4_V43C H3_F104C mutant nucleosome assembled in this project has shown itself to increase nucleosome structural integrity, possibly through the establishment of a disulphide bridge between L1 (loop 1) of core histone H4 and 2 (-helix 2) of core histone H3, conversely, hindering nucleosome mobility. This suggests that for nucleosome to slide along DNA in a noncatalyzed fashion, there must be a requirement of histone octamer plasticity. Moreover, structural analysis of Fkbp39, a putative histone chaperone in Saccharomyces pombe, both alone and in complex with (H2A-H2B) and with (H3-H4)2 was attempted with electron cryomicroscopy, though unsuccessful. Further optimization strategies are likely required to stabilize the putative complexes. Lastly, several chromatin-binding proteins were screened for binding to the nucleosome, as a complementary experiment. Hpf1, Parp2 and Alf from Homo sapiens seem like the best candidates for more in-depth studies to fully disclose their binding affinities to chromatin.Bilokapic-Halic, SilvijaCarvalho, Margarida Henriques da Gama,1972-Repositório da Universidade de LisboaCirilo, Alexandre Dias2018-11-07T17:45:47Z201820182018-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/35293TID:202188698enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:31:09Zoai:repositorio.ul.pt:10451/35293Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:49:46.737660Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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