Neuroprotective action of a kyotorphin derivative in an animal model of Alzheimer's disease
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| Data de Publicação: | 2016 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/23348 |
Resumo: | Tese de mestrado, Neurociências, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2016 |
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Neuroprotective action of a kyotorphin derivative in an animal model of Alzheimer's diseaseAβ peptideAlzheimer’s diseaseKyotorphin derivativeMemory impairmentsNeuroprotectionTeses de mestrado - 2016Domínio/Área Científica::Ciências MédicasTese de mestrado, Neurociências, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2016Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia. It is characterized by early memory deficits, followed by the gradual erosion of other cognitive functions. A hallmark of this disease is the accumulation of amyloid-‐beta (Aβ) peptide in the brain. Despite decades of effort and a massive investment, AD still represents a challenge for drug discovery, since an effective treatment is still needed. Kyotorphin (KTP), apart from being an endogenous analgesic peptide, has been pointed out as a putative neuroprotective molecule, although this has never been studied in the context of AD. Consequently, the aim of this work was to investigate the neuroprotective effect of prolonged treatment with KTP–NH2 (Amidated KTP, which can cross the blood-‐brain barrier) in a non-‐transgenic animal model of AD. Male Wistar rats (8-‐10 weeks) were intracerebroventricularly injected with 5 μL of Amyloid-‐β 1-‐ 42 (Aβ1–42) (2.25 mg/mL) at day zero. Then, starting at day 2, KTP-‐NH2 (100 μmol/kg) was intraperitoneally (i.p.) injected every day. Animals were tested in several behavioural paradigms, between days 15 and 20 and sacrificed at day 21 for immunohistochemistry and western blot analysis of the hippocampus. Values of P≤0.05 (one-‐way ANOVA followed by Holm-‐Sidak’s multiple comparisons test, or Student’s t-‐test) were considered to represent statistically significant differences. Results showed that Aβ1–42-‐injected rats displayed spatial working memory deficits assessed by the percentage of spontaneous alternation in the Y-‐Maze test as compared with controls (CTL, sham-‐ operated rats) (Aβ1-‐42: 55 ± 3.6 vs CTL: 69 ± 2.0; n= 6-‐7 animals per group; P≤0.05). However, when the animals were treated with KTP-‐NH2 the percentage of spontaneous alternation in the Y-‐Maze was similar to CTL group (Aβ1-‐42 KTP-‐NH2: 67 ± 1.3; n=6; P>0.05). Moreover, Aβ1–42-‐injected rats demonstrated episodic long-‐term memory deficits assessed by both object preference and object recognition indexes in the Novel Object Recognition (NOR) test (P≤0.05 as compared with CTL; n=6-‐7). Aβ 1–42-‐injected rats receiving KTP-‐NH2 scored in the NOR as CTL (P>0.05 as compared with CTL; P≤0.05 as compared with Aβ 1–42-‐injected rats not treated with KTP-‐NH2; n=6-‐7). None of the groups displayed impairments of locomotor performance (evaluated by the total number of arm entries in the Y-‐Maze and by Open Field (OF) test) or differences in the exploratory behaviour (evaluated by OF test) (P>0.05; n=6-‐7). Neuronal damage at the hippocampal cornus ammonis 1 and dentate gyrus, evaluated by immunohistochemistry and quantitative analysis of NeuN (neuronal marker) fluorescence, was evident in Aβ1–42-‐injected rats that did not receive KTP-‐NH2 (P≤0.05 as compared with CTL; n=3), but virtually absent in the Aβ1–42 group treated with KTP-‐NH2 (P>0.05 as compared with CTL; n=3). No signs of astrogliosis (evaluated by GFAP immunoreactivity) or microgliosis (evaluated by Iba-‐1 immunoreactivity) were detected using both immunohistochemistry and western blotting techniques (P>0.05; n≥3). The results suggest that KTP-‐NH2 reduces neurodegeneration as well as memory impairments induced by Aβ1–42 peptide, being potentially useful in the treatment of AD.A Doença de Alzheimer (Alzheimer’s disease – AD) é a doença neurodegenerativa mais comum em idosos e a forma mais frequente de demência. Com base no constante aumento da esperança média de vida nas sociedades ocidentais, estima-‐se que os casos de AD tripliquem até 2050. Os mais recentes dados epidemiológicos (2009) apontam para a existência de 153 000 pessoas com demência em Portugal, das quais 90 000 têm AD, ou seja, cerca de 1% do total da população nacional sofre desta patologia. Atualmente, sabe-‐se que a AD é caracterizada por uma deterioração progressiva das funções cognitivas, pela formação de placas senis e emaranhados neurofibrilares, bem como por uma profunda alteração nas respostas gliais, desregulação neuronal da homeostase do cálcio, disfunção colinérgica e extensa perda sináptica e neuronal. De igual modo, está descrito que o primeiro sinal de desenvolvimento de AD é a perda de memória. Assim sendo, é muito importante criar e utilizar modelos animais que exibam dificuldades de memória. Um exemplo de tal modelo animal é obtido pela injeção intracerebroventricular (i.c.v.) de β-‐amiloide (Aβ), que é o principal componente das placas senis. É também importante salientar que esta doença neurodegenerativa representa um dos maiores desafios no que diz respeito à descoberta de fármacos eficazes para a sua cura e, apesar de nos últimos 30 anos se ter tentado desenvolver um tratamento capaz de travar ou reverter a AD, infelizmente ainda não existe disponível um medicamento com estas potencialidades. Posto isto, torna-‐se evidente a necessidade de se investigar novas moléculas que se considerem promissoras no contexto da terapêutica de AD. Uma dessas moléculas é a Quiotorfina (Kyotorphin – KTP) – dipéptido endógeno (constituído por L-‐tirosina e L-‐arginina). Este dipéptido foi encontrado pela primeira vez, em 1979, num encéfalo bovino e desde então foi também isolado a partir de encéfalos de várias espécies, incluindo o líquido cefalorraquidiano (cerebrospinal fluid -‐ CSF) de humanos. Estudos anteriores sugerem que a KTP tem propriedades neuroprotetoras nomeadamente no hipocampo e no cerebelo, para além de desempenhar um papel primordial na regulação da dor no sistema nervoso central. Contudo, falta ainda saber se esta molécula tem uma ação neuroprotetora num modelo animal de AD. Sabe-‐se que a sua ação protetora poderá estar relacionada com a capacidade de inibir correntes de cálcio na membrana pós-‐sináptica.. Por outro lado, o seu efeito analgésico é 4,2 vezes superior ao da metionina-‐encefalina (Methionine-‐enkephalin – met-‐enk), um pentapéptido opioide endógeno. Embora apresente uma atividade opioide, pois a sua ação é prevenida por antagonistas de recetores de opioides, provou-‐se que a KTP não se liga, in vitro, aos subtipos mu-‐, delta-‐ ou kappa dos recetores de opioides. Este facto levou à hipótese de um mecanismo de ação indireto, através da ligação a um recetor específico. Como este recetor ainda não foi identificado, os detalhes do mecanismo de ação da KTP são desconhecidos, tendo sido, no entanto, sugeridas duas hipóteses: a ativação do recetor pela KTP leva à libertação de met-‐enk, que leva à ativação de um recetor opioide; ou a KTP é degradada rapidamente e a L-‐arginina formada é utilizada pelo enzima óxido nítrico sintetase que leva à formação de óxido nítrico, que por sua vez induz a libertação de met-‐enk. Devido à reduzida capacidade de atravessar a barreira hematoencefálica (Blood-‐brain barrier – BBB), a atividade analgésica da KTP em modelos animais foi apenas observada quando a molécula era injetada diretamente no cérebro. De modo a ultrapassar tal limitação, sintetizaram-‐se derivados da KTP. Um desses derivados resultou da substituição do grupo carboxilo terminal por um grupo amida (KTP-‐ NH2). Esta modificação, ao aumentar a carga global do péptido e a sua hidrofobicidade, melhora a sua interação para com as membranas biológicas, permitindo assim atravessar a BBB. Estudos clínicos recentes têm vindo também a reforçar a hipótese de uma ligação entre a AD, dor e a KTP em seres humanos. Alguns estudos apontam que a dor é subestimada em doentes com Alzheimer e que estes doentes apresentam níveis diminuídos de KTP no CSF. Adicionalmente, verificou-‐ se também uma correlação inversa entre os níveis de proteína fosforilada-‐tau (um marcador molecular de progressão de AD) e de KTP. Assim sendo, uma dupla ação, analgésica e neuroprotetora, num único fármaco seria de extrema importância, no contexto da dor e neurodegeneração na AD. Para além disso, como os níveis deste dipéptido endógeno neuroprotetor estão diminuídos em pacientes com AD, torna-‐se interessante avaliar se a sua aplicação exógena (ou dos seus derivados) pode travar algumas das disfunções associadas à AD. Consequentemente, o objetivo deste trabalho foi investigar as potencialidades da KTP-‐NH2, de que existem vários indícios que atravessa a BBB, no combate à progressão da AD. Avaliei então a capacidade desta molécula para reduzir alguns dos sintomas característicos da AD, nomeadamente o defeito de memória e a morte neuronal. Para tal, usei um modelo animal de AD – ratos machos Wistar (8-‐10 semanas de idade) injetados i.c.v. com 5 μL do péptido Aβ1-‐42 (2,25 mg/mL) no dia zero. A partir do dia 2, KTP-‐NH2 (100 μmol/ kg) foi intraperitonealmente (i.p.) injetada todos os dias. Os animais foram testados em diversos paradigmas comportamentais a partir do dia 15 até ao dia 20. No dia 21 foram sacrificados para análises imuno-‐ histoquímicas e de western blot dos hipocampos. Valores de P≤0,05 (Análise de Variância com um fator (one-‐way ANOVA) seguida do teste Holm-‐Sidak para múltiplas comparações, ou Teste t de Student) foram considerados para representar diferenças estatisticamente significativas. Os resultados obtidos demonstraram que os ratos injetados i.c.v. com Aβ1-‐42 (ratos Aβ1-‐42) exibiram défices na memória de trabalho espacial avaliada no teste do Labirinto em Y (Y-‐Maze) – ao compará-‐los com os ratos controlo (CTL, ratos sham-‐operated) (Aβ1-‐42: 55 ± 3,6 vs CTL: 69 ± 2,0; n= 6-‐7 XIX animais por grupo; P≤0,05). Contudo, quando os animais foram tratados com KTP-‐NH2 a percentagem de alteração espontânea no Y-‐Maze foi semelhante ao grupo controlo (Aβ1-‐42 KTP-‐NH2: 67 ± 1,3; n=6; P>0,05). Adicionalmente, os ratos Aβ1-‐42 revelaram défices na memória episódica a longo prazo que foi avaliada tanto pelo índice de preferência do objeto como pelo índice de reconhecimento do objeto no teste de Reconhecimento do Novo Objeto – Novel Object Recognition test (NOR) (P≤0,05 comparando com os ratos CTL, n=6-‐7). Os ratos Aβ1-‐42 que foram tratados com KTP-‐NH2 tiveram uma prestação semelhante à dos ratos CTL no teste NOR (P>0,05 comparando com os ratos CTL; P≤0,05 comparando com os ratos Aβ 1–42 que não foram tratados com KTP-‐NH2; n=6-‐7). Nenhum dos grupos demonstrou disfunção locomotora (avaliado pelo número total de entradas nos braços do Y-‐Maze e pelo teste do Campo Aberto – Open Field (OF) test), nem perturbações na atividade exploratória (avaliado pelo teste OF) (P>0,05; n=6-‐7). O dano neuronal no cornus ammonis 1 e corpo tufado (dentate gyrus) do hipocampo, avaliado pela técnica de imuno-‐histoquímica e análise quantitativa da fluorescência do NeuN (marcador neuronal), foi evidente nos ratos Aβ1-‐42 que não foram tratados com KTP-‐NH2 (P≤0,05 comparando com ratos controlo; n=3), mas virtualmente ausente nos ratos Aβ1-‐42 tratados com KTP-‐ NH2 (P>0,05 comparando com os ratos CTL; n=3); Não foram detetados, em nenhum dos grupos experimentais, sinais de astrogliose (avaliado pela imunoreatividade do GFAP) nem de microgliose (avaliado pela imunoreatividade do Iba-‐1), usando tanto a técnica de imuno-‐histoquímica com a de western blot (P>0,05; n≥3). Estes resultados sugerem que a KTP-‐NH2 reduz a neurodegeneração no hipocampo assim como défices de memória induzidos pelo péptido Aβ1–42, podendo ser potencialmente útil no tratamento da AD. Estudos futuros de farmacocinética e farmacodinâmica são necessários para descobrir quais os alvos moleculares da KTP e dos seus derivados, de modo a otimizar ao máximo o potencial terapêutico desta molécula.Sebastião, Ana Maria, 1958-Castanho, Miguel Augusto Rico Botas, 1967-Repositório da Universidade de LisboaMartins, Margarida Leonor Ferreira, 1992-2019-02-24T01:30:11Z20162016-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/23348TID:201051699enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2024-11-20T17:28:01Zoai:repositorio.ul.pt:10451/23348Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openairemluisa.alvim@gmail.comopendoar:71602024-11-20T17:28:01Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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