Development of nanostructured lipid carriers loaded with atorvastatin for the effective delivery and treatment against glioblastoma cells
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| Data de Publicação: | 2020 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/54067 |
Resumo: | Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2020, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia. |
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Development of nanostructured lipid carriers loaded with atorvastatin for the effective delivery and treatment against glioblastoma cellsGlioblastoma multiformeSLNNLCAtorvastatinTPGSChitosanHyaluronic acidTese de mestrado - 2020Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2020, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.O glioblastoma multiforme (GBM) é o tipo de tumor cerebral mais comum e maligno. O tratamento padrão consiste na remoção cirúrgica do tumor, seguida de radioterapia e quimioterapia. No entanto, na maioria dos pacientes, a recorrência do tumor geralmente aparece alguns meses após o tratamento. Vários fatores estão relacionados com a falha no tratamento do GBM, como a localização do tumor no cérebro que torna a remoção total da massa tumoral um procedimento crucial, a presença da barreira hematoencefálica (BHE) que impede a penetração da maioria dos fármacos no sistema nervoso central sistema (SNC), a natureza heterogénea das células GBM e os múltiplos mecanismos de resistência desenvolvidos por essas células. Por esse motivo, existe uma necessidade significativa de desenvolver um sistema de veiculação de fármacos que possa melhorar a liberação no cérebro e, consequentemente, os resultados do tratamento. As nanopartículas de lipídios sólidos (SLN) e os transportadores lipídicos nanoestruturados (NLC) são atualmente considerados dos sistemas mais promissores para a veiculação de fármacos para o SNC. A estrutura e/ou a superfície destas nanopartículas podem ser modificadas usando diferentes estratégias com o objetivo de melhorar o cruzamento da BHE, o direcionamento seletivo para as células tumorais, a superação da resistência das células GBM, entre outros. O conceito de “reaproveitamento de fármacos” foi introduzido nos últimos anos como uma forma de utilizar substâncias activas pré-existentes e seguras no tratamento de pacientes com cancro cerebral primário e recorrente com base no perfil molecular do tumor. As Estatinas são uma família de fátmacos amplamente utilizada no tratamento da hipercolesterolémia através da inibição da 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMGCoA) redutase, impedindo assim a biossíntese do colesterol. Vários estudos in vitro e in vivo demonstraram propriedades antineoplásicas da Atorvastatina (ATR) contra células de GBM. Estas propriedades antitumorais incluem indução de apoptose, invasão tumoral e redução da metastização e inibição de vias inflamatórias. No entanto, este fármaco hidrofóbico não pode ser administrado facilmente por via intravenosa, e a baixa biodisponibilidade observada após administração oral dificulta a obtenção de concentrações terapêuticas eficazes contra o GBM. Neste estudo, desenvolvemos uma nova formulação de ATR obtida por encapsulação em NLC (ATR-NLCs)e subseqientemente modificada para incluir: (1) succinato de D-ɑtocoferil polietilenoglicol (TPGS) para aumentar a absorção celular pela inibição da atividade de efluxo de P-glicoprotien (P-gp); (2) O quitosano para obter NLCs catiónicas de modo a aumentar apermeabilidade da BHE; e (3) O ácido hialurónico (HA) para vectorização para as células de GBM. Como o tamanho de partícula das NLC desempenha um papel crucial na vectorização para o cérebro, e também na clearance das nanopartículas, nosso objetivo primeiro foi desenvolver um sistema de veiculação com um tamanho de partícula <200 nm. As SLN e NLC, particularmente aqueles no intervalo de 120–200 nm, são menos aprisionados pelas células do MPS (Sistema Mononuclear Fagocitário) e, portanto, escapam parcialmente à retenção no fígado e do baço. Consequentemente, apresentam tempos de circulação mais longos, o que favorece o contacto com a BHE. A otimização da formulação foi realizada por meio de estudo de triagem para as variáveis de composição das NLC, incluindo tipo de lípido sólido, tipo de lípido líquido, e respectiva proporção, e tipo e concentração de agente tensioactivo. A técnica de homogeneização a quente foi escolhida como método de preparação por ser um método simples e económico que não inclui o uso de solventes orgânicos. Além disso, para uma perspetiva futura, este método é facilmente transponível para a escala industrial. Os agentes tensioactivos da família dos ploxâmeros (Pluronic®) são conhecidos por produzir nanopartículas estáveis, apresentando baixa toxicidade e alta biocompatibilidade. Para além disso modificam a atividade das proteínas transportadoras de efluxo, aumentando permeabilidade através da BHE. No presente trabalho foram investigados dois agentes tensioactivos desta família: Pluronic® F68 e Pluronic® F127. Tendo as NLC produzidas com Compritol®888 ATO e Pluronic® F86 apresentado tendência para agregação, o Precirol® foi selecionado como o lípido sólido e testado com Pluronic® F127 (0.5% w/v). As SLN resultantes apresentaram um tamanho de partícula de 124.1 nm e um índice de polidispersão (PI) de 0,363. De entre os quatro lípidos líquidos selecionados, a introdução de Transcutol® HP na formulação anterior, na proporção de 1:3 (lipido líquido/sólido), originou um tamanho de partícula de 114,8 nm, um valor de (PI) de 0,724 e valor de potencial zeta de -35,3 mV. Esta formulação de NLC otimizada foi então usada para incorporar ATR (ATR-NLC). Subsequentemente, a formulação ATR-NLC não modificada e as três formulações modificadas: TPGS-ATR-NLC, quitosano-ATR-NLC e ácido hialurónico-ATR-NLC foram então caracterizadas e testadas in vitro em cultura celulares relevantes U87 e U373. Todas as formulações de NLC contendo ATR formaram nanopartículas distribuídas monomodalmente com um tamanho de partícula entre 102,4 ± 5,8 nm e 131,4 ± 4,9 nm. A introdução de TPGS resultou na diminuição do tamanho de partícula, pois esta molécula atuou como co-tensioactivo e reduziu a tensão interfacial entre a matriz lipídica e o meio de dispersão (fase aquosa). Os valores de ZP variaram entre -23,2 mV e -27,9 mV. A adição de quitosano originou partículas com uma ligeira carga positiva (+1,4±5,2 mV) que permitiu posteriormente a adsorção eletrostática de HA. A última formulação, que incluiu o revestimento da formulação de quitosano com há, apresentou uma mudança no ZP de valor positivo para negativo (-27,9±2,2 mV) devido à natureza polianiónica das moléculas de HA, fornecendo evidência para o revestimento das nanopartículas por cadeias de HÁ. A análise morfológica por microscopia eletrónica de transmissão (TEM) revelou partículas esféricas nas quatro formulações de NLC desenvolvidas. A formulação de quitosano-ATR-NLCs apresentou partículas de formato irregular, enquando a formulação HA-CS-NLC mostrou a existência de um núcleo denso regular com uma coroa uniforme que confirma o revestimento de HA. A análise por espectroscopia de infravermelho com transformadas de Fourier (FT-IR) provou que não existem possíveis interações fármacoexcipiente em qualquer das formulações. As nanopartículas apresentaram valores de de eficiência de encapsulação (EE) superiores a 70%, o que sugere que os sistemas desenvolvidos são transportadores adequados para a incorporação de ATR, confirmado pelo facto de este fármaco ser de natureza hidrofóbica (logP = 5,39). Os perfis de libertação do fármaco in vitro mostraram, em todas as formulações, uma libertação inicial de cerca de 50% nas primeiras duas horas, seguida por uma fase de libertação sustentada. O estudo de estabilidade durante 3 meses de armazenamento a 4±1°C não revelou diferenças significativas no tamanho das partículas e PI, sugerindo claramente que uma concentração ótima de Pluronic F127 de 0,5% foi suficiente para cobrir a superfície das nanopartículas de forma eficaz e evitar a aglomeração durante o processo de homogeneização. A captação celular de ATR-NLC marcados com cumarina, pelas células U87 e U373, depende da concentração, e quantidade de nanopartículas captadas aumentou com o aumento da concentração aplicada. Os exames por microscopia de fluorescência forneceram uma evidência profunda de que as partículas estavam com alto grau de fixação celular no citoplasma das células de glioma, tendo sido observada um aumento da captação nas formulações com TPGS-ATR-NLCs e HA-ATR-NLCs. O efeito citotóxico in vitro das nanopartículas de ATR e fármaco livre em células U87 e U373 foi estudado pelo método do iodeto de propídio (PI) e pelo ensaio Alamar Blue. Os resultados obtidos revelaram valores de captação de PI aproximadamente iguais ao valor do controlo negativo (≈1), o que indica a presença de células viáveis com membranas celulares intactas, enquanto o controlo positivo revelou o valor de PI ≈1,5 que indica a presença de células não viáveis. Esses resultados significam que as formulações não têm efeito sobre a integridade da membrana nas células-alvo. Os resultados obtidos no ensaio Alamar Blue realizado em células U373 (após 72h de incubação com as formulações) mostraram que a solução livre do fármaco apresentou 61,6% de viabilidade celular. Considerando que, ATR-NLCs, TPGS-ATR-NLCs, quitosano-ATR-NLCs e HA-ATRNLCs mostraram 22,9%, 9,08%, 22,4% e 35,7%, respetivamente. Da mesma forma, na mesma condição de tempo de incubação e concentração nas células U87, a solução livre do fármaco apresentou viabilidade celular de 67,3%. Enquanto ATR-NLCs, TPGS-ATRNLCs, chitosano-ATR-NLCs e HA-ATR-NLCs exibiram valores de viabilidade celular de 35,5%, 21,4%, 29% e 54,7%, respetivamente, embora a modificação com quitosano e ácido hialurónico não originou uma diferença significativa em termos de citotoxicidade quando comparada com a formulação de ATR-NLCs não modificada, os nossos resultados forneceram uma evidência profunda da captação celular aumentada e efeito citotóxico quando a formulação foi modificada com TPGS. Neste estudo, estabelecemos uma forte evidência do uso de NLCs como um sistema de nanopartículas promissor para a entrega de ATR e mostrámos que o TPGS-ATR-NLC é uma nova formulação com enorme potencial para a veiculação de fármacos para o tratamento do GBM. Esta hipótese será posteriormente validada através da realização de futuros estudos in vivo.Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and malignant type of brain tumor. The standard treatment of GBM includes the surgical resection of tumor, followed by radiotherapy and chemotherapy. However, in most patients, tumor recurrence usually appears a few months after the standard treatment. Various factors are related with GBM treatment failure, such as tumor location in the brain which makes the total removal of tumor mass a crucial procedure, the presence of the blood-brain barrier (BBB) that hinders the penetration of most drugs to the central nervous system (CNS), the heterogeneous nature of GBM cells, and the multiple resistance mechanisms developed by those cells. For this reason, there was a significant need to develop a drug carrier that could improve the delivery into the brain, and consequently treatment outcomes. In this context, solid lipid nanoparticles (SLNs) and nanostructured lipid carriers (NLCs) represent one of the most promising carriers for therapeutics delivery into CNS. The structure and/or the surface of those valuable drug carriers could be modified using different strategies aiming at improving crossing the BBB, the selective targeting of tumor cells, overcoming GBM cells resistance, and others. The concept of “Drug repurposing” was introduced in the recent years as a way to utilize pre-existing safe drugs in the treatment of primary and recurrent cancer patients, based on the molecular signature of the tumor. Statins are a family of drugs that is widely used in the treatment of hypercholesterolemia through inhibition of 3-hydroxy-3- methylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reductase thus potentially inhibit cholesterol biosynthesis. Various in vitro and in vivo studies have demonstrated beneficial antineoplastic properties of Atorvastatin (ATR) against GBM cells. These anti-tumor properties include apoptosis induction, tumor invasion and migration reduction, and inflammatory pathways inhibition. However, this hydrophobic drug cannot be administered easily through intravenous route, and the low bioavailability noticed after oral administration makes it difficult to reach the sufficient concentration to obtain anti- GBM effect. To solve this dilemma, we developed an NLC formulation to incorporate ATR and enhance drug delivery in vitro to U87 MG and U373 cells. Firstly, a screening study was carried out to select the NLC components that provide a homogeneous NLCs dispersion with particle size <200 nm, and the optimized NLC formulation was consisted of Precirol® as the solid lipid, Transcutol® HP as the liquid lipid, and Pluronic® F127 as the surfactant. ATR-NLC were produced by hot homogenization method, and the formulation was modified to include: (1) D-ɑtocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) to enhance cellular uptake by the inhibition of P-glycoprotien (P-gp) efflux activity, (2) chitosan to obtain cationic NLCs with enhanced BBB-permeability properties, and (3); hyaluronic acid (HA) for GBM targeted treatment. A spherical shape, particle size around 116.0±5.6 nm and a polydispersity index (PDI) value around 0.399±0.051, with an encapsulation efficiency (EE) and drug loading (DL) around 80% and 5% respectively, were obtained with all formulations. FT-IR results confirmed compatibility between drug and formulation excipients. The introduction of TPGS resulted in more sustained release of drug from the formulation, increases cellular uptake and synergise the cytotoxic effect of the drug. ATR-NLC formulation modified with chitosan and HA have shown good results in term of drug release and cellular uptake but they did not present increased cytotoxic effect comparing with non-modified formulation. No significant differences in particle size and PDI between fresh formulations and the ones stored for six months later which indicates long term stability. Hence, the present study established the use of the developed NLC as a carrier for ATR in GBM treatment and that the addition of TPGS can synergize the anticancer activity of ATR-containing NLC formulations, and thus, offer a promising anticancer delivery system for ATR.Com o patrocínio da Fundação de Ciência e Tecnologia (FCT).Gonçalves, Lídia M.D.Almeida, António J.Repositório da Universidade de LisboaJnaidi, Raneem2022-12-04T01:32:11Z2020-12-042020-10-302020-12-04T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/54067TID:202988864enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T17:00:27Zoai:repositorio.ul.pt:10451/54067Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:05:04.063985Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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