Desenvolvimento e otimização da técnica Lamp (L00P-MEDIATED ISOTHERMAL DNA AMPLICACATION) para a identificação das principais genoespécies do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato

• Autor(a) principal: NASCIMENTO, Marta Maria Almeida Dias do
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10362/18576
• topic: Microbiologia médica; Bacteriologia; Infeção; Diagnóstico; Domínio/Área Científica::Ciências Médicas

A Borreliose de Lyme é uma infeção causada por bactérias (espiroquetas), pertencentes ao complexo Borrelia burgdorferi sensu lato, que são transmitidas por mordedura de carraças principalmente do género Ixodes. As espécies mais prevalentes na Europa são B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii, B. valaisiana e B. lusitaniae. A doença pode afetar diversos órgãos e sistemas de acordo com o tropismo de cada espécie (da pele às manifestações neurológicas). O diagnóstico laboratorial é difícil, sendo necessário desenvolver/implementar novos testes que sejam sensíveis, rápidos e baratos. O principal objetivo deste trabalho foi desenvolver uma técnica de amplificação molecular isotérmica, Loop-Mediated Amplification – LAMP, em duplex, para deteção e identificação de quatro das referidas espécies de Borrelia, tendo como alvo o gene flaB, codificante da proteína flagelina. Foi desenhado um conjunto de primers para cada espécie de Borrelia, com 100% de especificidade. Para a otimização das condições de amplificação de DNA pela técnica LAMP, foram escolhidos os primers para B. lusitaniae. Foram também realizadas reações nested-PCR para o espaço intergénico 5S(rrf)-23S(rrl) e gene flaB e ainda qPCR para este último gene. Após a otimização a técnica foi aplicada a carraças e a amostras humanas (soro e líquor) para deteção/identificação de Borrelia. A amplificação de DNA, mostrou valores diferentes de sensibilidade consoante as espécies, de 2,5pg/μl a 2500pg/μl de DNA para B. lusitaniae e B. garinii respetivamente e os resultados obtidos com as reações de nested-PCR e qPCR variaram de 0,05 a 5pg/μl. A exatidão da técnica LAMP para B. lusitaniae quando comparada com as outras técnicas moleculares foi semelhante, pelo que se admite que com primers desenhados para o género Borrelia, ter-se-ia obtido melhor sensibilidade para todas as espécies, com a vantagem da reação ocorrer num único tubo em menos de uma hora, com visualização do resultado a olho nu. Apesar das limitações, a técnica LAMP é uma ferramenta promissora para o diagnóstico laboratorial da Borreliose de Lyme.